一種水稻抗褐飛虱基因Bph3的等位變異及其基因標記應用的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學和農(nóng)業(yè)領域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因Bph3的等位變異及其基因標記應用。

背景技術：

稻飛虱是我國和許多亞洲國家水稻主要病蟲害之一，其不僅能通過刺吸方式直接為害水稻，還能傳播水稻草狀叢矮病(Grass Stunt)和齒葉矮縮病(Raggde Stunt)。稻飛虱，昆蟲綱同翅目(Homoptera)飛虱科(Delphacidae)害蟲。俗名火蠓蟲。以刺吸植株汁液為害水稻等作物。常見種類有褐飛虱(Nilaparvata lugens)、白背飛虱(Sogatella furcifera)和灰飛虱(Laodelphax striatellus)，其中以褐飛虱危害最為嚴重。當?shù)撅w虱為害嚴重時，稻株成片枯黃，倒伏，俗稱“虱燒”。一直以來，化學防治在控制褐飛虱為害中起到很重要的作用，但是大量的使用化學藥劑不僅污染環(huán)境，也將很多益蟲殺死，破壞生態(tài)平衡，而且導致稻飛虱抗藥性增加，致使褐飛虱為害加重。

實踐證明，利用水稻品種自身的抗蟲特性是一種對環(huán)境友好、經(jīng)濟有效的防治手段。因此，研究與利用水稻抗稻飛虱基因是水稻飛虱防治的重要措施。

1967年，Pathak等率先鑒定出了一批抗褐飛虱資源材料。1968年，抗飛虱育種和基因定位計劃開始實施。1971年，Athwal等率先鑒定出抗褐飛虱基因Bph1和bph2；迄今為止，已鑒定出抗褐飛虱主效基因至少有30個。Du等(Du B.,W.Zhang,B.Liu,et al.Identification and characterization of Bph14,a gene conferring resistance to brown planthopper in rice.Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(52):22163-22168.)率先利用圖位克隆的方法獲得抗褐飛虱基因Bph14，并通過互補實驗和RNAi干擾驗證了該基因的功能，并對該基因進行了功能分析。研究結果表明Bph14編碼一個包含1323個氨基酸的蛋白，該蛋白包含一個CC-NB-LRR結構域。隨后，BPH26(Tamura,Y.,et al.,Map-based cloning and characterization of a brown planthopper resistance gene BPH26 from Oryza sativa L.ssp.indica cultivar ADR52.Sci Rep,2014.4:p.5872)、Bph3(Liu,Y.,et al.,A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice.Nat Biotechnol,2015.33(3):p.301-305)、BPH29(Wang,Y.,et al.,Map-based cloning and characterization of BPH29,a B3 domain-containing recessive gene conferring brown planthopper resistance in rice.J Exp Bot,2015.66(19):p.6035-45)分別被克隆出來。其中BPH26和BPH29為隱性抗褐飛虱基因，而Bph3為一個顯性廣譜抗稻飛虱基因。

Lakshinarayana等(1977)在Rathu Heenati中鑒定出了一個新的顯性抗蟲基因，命名為Bph3。Sidhu等(1978)對20個抗蟲品種進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)有7個品種含有Bph3，有10個品種含有bph4，剩下的3個品種同時含有Bph3和bph4。Ikeda等(1981)運用三體定位法把Bph3和bph4定位在7號染色體上。隨后黃朝鋒利用RH×七絲軟占的F2作圖群體對水稻抗褐飛虱基因Bph3進行分子定位，將Bph3基因定位在第4染色體長臂上PSM323和PSM194兩標記之間。但是Jairin等(Jairin J.,K.Phengrat,S.Teangdeerith,et al.Mapping of a broad-spectrum brown planthopper resistance gene,Bph3,on rice chromosome 6.Molecular breeding,2007,19(1):35-44.)分別以IR71033-121-15/KDML105的F2群體，Rathu Heenati/KDML105構建的BC3F2群體和PTB33/RD6構建的BC1F2群體為研究材料，利用SSR標記將Bph3定位于第6染色體RM589-RM588之間，遺傳距離分別是0.8cM和0.6cM。Jairin等(Jairin J.,S.Teangdeerith,P.Leelagud,et al.Detection of brown planthopper resistance genes from different rice mapping populations in the same genomic location.Sci.Asia,2007,33:347-352)用Rathu Heenati/KDML105的BC3F3群體將Bph3定位在6號染色體SSR標記RM19291與RM8072之間的190kB的區(qū)域。萬建民等利用水稻抗蟲品種Rathu Heenati(♀)與感蟲品種02428(♂)雜交獲得的F2各單株的基因型和F_2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品種Rathu Heenati抗褐飛虱主基因Bph3，將其定位在第4染色體分子標記A4和RM16533之間(萬建民等，水稻品種抗褐飛虱主基因Bph3的分子標記方法，專利授權號：ZL200810243722.4)。

最后，Liu,Y.,et al.(Liu,Y.,et al.,Agene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice.Nat Biotechnol,2015.33(3):p.301-305)將Bph3從水稻品種Rathu Heenati克隆出來，發(fā)現(xiàn)Bph3是由三個編碼凝集素受體激酶基因組成的一個基因簇，對褐飛虱和白背飛虱都有廣譜持久的抗性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一個水稻抗褐飛虱基因Bph3的等位變異及其基因標記應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一個水稻抗褐飛虱基因Bph3的等位變異體Bph3^p，其特征在于：所述等位變異體Bph3^p的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本發(fā)明采用精細定位和候選基因克隆測序的方法，分離到水稻抗褐飛虱基因Bph3^p，通過分子標記選擇和構建近等基因系方法，證實了該基因的功能。

SEQ ID No.1序列全長5587bp，與抗褐飛虱品種Rathu Heenati的等位基因片段SEQ ID No.3相比較，在第263bp處有一個9bp堿基的插入片段；

SEQ ID No.2序列全長4237bp，與抗褐飛虱品種Rathu Heenati的等位基因片段SEQ ID No.4相比較，在第1505bp處有一個17bp堿基的插入片段，而第1539bp處堿基由Bph3基因的G突變?yōu)門，該插入片段和點突變均處于啟動子區(qū)域，應當理解，本發(fā)明Bph3^p基因為Bph3基因自然變異，而非人工改變，致使本發(fā)明Bph3^p基因與Bph3基因存在實質性的差異，為Bph3基因的一個具有褐飛虱抗性的等位基因。

本發(fā)明另一個目的是提供一種抗褐飛虱基因Bph3^p在水稻選育和抗褐飛虱選育中的應用，所提供的三個分子標記不僅能地鑒定Bph3^p存在與否，而且能夠很好地區(qū)分Bph3^p和Bph3。通過檢測這些分子標記，可以預測水稻植株的稻飛虱抗性，加快抗稻飛虱育種速度，簡化選育手段。

本領域技術人員應當理解，根據(jù)本發(fā)明公開的序列來設計或產(chǎn)生的分子標記可用于抗褐飛虱水稻選育育種。

本發(fā)明通過如下步驟獲得并驗證Bph3^p基因及其分子標記：

1、Bph3^p基因的初步定位

用抗蟲品種SD和感蟲品種TN1(見圖1)雜交構建SD×TN1F_2:3家系，以及(SD×TN1)×G46A三交群體分析SD褐飛虱抗性遺傳特征。結果顯示，SD×TN1F2:3抗蟲家系數(shù)：抗感分離家系數(shù)：感蟲家系數(shù)＝70:131:72，經(jīng)χ²檢驗，符合1：2：1的比例(χ2＝0.361＜χ0.05，22＝5.99)，表明SD的抗蟲性受一個顯性基因控制；三交群體單苗鑒定結果顯示，抗蟲單株數(shù)：感蟲單株數(shù)＝122：153，經(jīng)χ2檢驗，符合1:1的分離比(χ2＝3.28＜χ0.05,12＝3.84)，進一步驗證了SD抗褐飛虱特性由一個顯性基因控制。利用SD×TN1的F_2：3隱性群體，采用SSR標記、INDEL標記和SNP標記將SD抗褐飛虱基因定位在第4染色體短臂上的分子標記SN8與SN11之間，該基因與兩個標記的遺傳距離均是2.8cM，與分子標記RM16489、HST3、SN9共分離(見圖2)。并暫定名為“Bph-SD”。(見黃??；水稻品種SD抗褐飛虱的遺傳分析及初步定位；四川農(nóng)業(yè)大學；2014年碩士論文)

表1.F_2:3隱性群體中交換單株基因型鑒定結果

A表示與抗蟲親本SD相同帶型，B表示與感蟲親本TN1相同帶型，H表示雜合帶型。其中RM16428、RM16489、RM16514是SSR標記，HST3是InDel標記，SN1、SN7、SN8、SN9、SN11、SN13、SN15是SNP標記，1-22為交換單株編號。

2、Bph3^p基因精細定位與確認

選取4株表型為褐飛虱抗性，基因型為初步定位區(qū)段雜合型而兩端為感蟲親本TN1相同帶型F₂單株的種子共4000粒，發(fā)芽移栽種植，分蘗期取葉片分析基因型，對在定位區(qū)段發(fā)生交換的單株，鑒定F_2：3家系褐飛虱抗性。同時，利用 生物信息學方法，分析在SN8與SN11之間的SNP和InDel位點，并設計SNP和InDel引物。最終將抗性基因精細定位在SNP標記In1和In2之間(見圖3,4)，即6939507bp～6969271bp之間；該區(qū)段包含5個基因，分別是LOC_s04g12540、LOC_s04g12550、LOC_s04g12560、LOC_s04g12570和LOC_s04g12580，其中LOC_s04g12540、LOC_s04g12560和LOC_s04g12580被注釋為表達的類似受體蛋白激酶，于是對這3個基因進行了克隆測序分析。此時發(fā)現(xiàn)與Liu,Y.,et al.(Liu,Y.,et al.,A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice.Nat Biotechnol,2015.33(3):p.301-305)報道的Bph3為同一位點。于是將來自水稻品種SD、Ptb33和Rathu Heenati的Bph3基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)來自SD和Ptb33的SEQ ID No.1(LOC_s04g12560)序列全長5587bp，與抗褐飛虱品種Rathu Heenati的等位基因片段SEQ ID No.3(LOC_s04g12560)相比較，在第263bp處有一個9bp堿基的插入片段；來自SD和Ptb33的SEQ ID No.2(LOC_s04g12580)序列全長4237bp，與抗褐飛虱品種Rathu Heenati的等位基因片段SEQ ID No.4LOC_s04g12580)相比較，在第1505bp處有一個17bp堿基的插入片段，而第1539bp處堿基由Bph3基因的G突變?yōu)門。因此，將SD和Ptb33在該位點的抗褐飛虱基因命名為“Bph3^p”

3、區(qū)分抗褐飛虱基因Bph3與其等位基因Bph3p的分子標記

根據(jù)序列來自SD和Ptb33的SEQ ID No.2(LOC_s04g12580)與抗褐飛虱品種Rathu Heenati的等位基因片段SEQ ID No.4(LOC_s04g12580)在第1505bp處有一個17bp堿基的插入缺失片段，設計了InDel標記InDel80。該引物在含有Bph3基因的植株DNA為模板時，可以擴增出一條432bp的條帶來；在含有Bph3^p基因的植株DNA為模板時，可以擴增出一條449bp的條帶。其反應條件均為：PCR反應總體系50μl:cDNA模板2μl，10×buffer5μl，10mMdNTP2μl,10μM引物各3μl，高保真Taq酶1U。反應程序：預變性94℃4min；然后35個循環(huán)，變性95℃20s，58℃40s,72℃30s；再72℃延伸7min。

本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明基因Bph3^p為Bph3基因自然變異，而非人工改變，為Bph3基因的一個具有褐飛虱抗性的等位基因，這豐富了褐飛虱抗性基因資源。

本發(fā)明所設計的基因引物，為抗褐飛虱分子育種提供了精確地選擇工具，將會極大地減少抗褐飛虱田間鑒定工作量和縮短抗褐飛虱育種年限。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1水稻品種SD和TN1植株褐飛虱抗性鑒定；

圖2本發(fā)明中Bph3^p基因的初步定位；

圖3本發(fā)明中Bph3^p基因精細定位；

圖4本發(fā)明中分子標記In1在分離群體中的擴增效果；

圖5本發(fā)明中分子標記In1在分離群體中的擴增效果；

圖6本發(fā)明中分子標記InDel80區(qū)分Bph3^p和Bph3的擴增效果；

圖7本發(fā)明中Bph3^p基因在改良材料中褐飛虱抗性表現(xiàn)。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

1、Bph3^p基因的定位

利用72個SD×TN1的F_2：3隱性群體，采用SSR標記、INDEL標記和SNP標記將SD抗褐飛虱基因定位在第4染色體短臂上的分子標記SN8與SN11之間，該基因與兩個標記的遺傳距離均是2.8cM，與分子標記RM16489、HST3、SN9共 分離。并暫定名為“Bph-SD”。(見黃??；水稻品種SD抗褐飛虱的遺傳分析及初步定位；四川農(nóng)業(yè)大學；2014年碩士論文)

表2.F_2:3隱性群體中交換單株基因型鑒定結果

A表示與抗蟲親本SD相同帶型，B表示與感蟲親本TN1相同帶型，H表示雜合帶型。其中RM16428、RM16489、RM16514是SSR標記，HST3是InDel標記，SN1、SN7、SN8、SN9、SN11、SN13、SN15是SNP標記，1-22為交換單株編號。

選取4株表型為褐飛虱抗性，基因型為初步定位區(qū)段雜合型而兩端為感蟲親本TN1相同帶型F₂單株的種子共4000粒，發(fā)芽移栽種植，分蘗期取葉片分析基因型，對在定位區(qū)段發(fā)生交換的單株，鑒定F_2：3家系褐飛虱抗性。同時，利用生物信息學方法，分析在SN8與SN11之間的SNP和InDel位點，并設計SNP和InDel引物。發(fā)現(xiàn)SD褐飛虱抗性與InDel標記In1和In2存在100％的連鎖。

2、Bph3^p基因及其分子標記應用

本例中利用InDel標記In1和In2，來選擇具有抗褐飛虱功能的水稻，標記In1擴增片段為355bp，In2擴增片段為189bp。提取抗褐飛虱品種SD和Ptb33、感褐飛虱品種及其雜交或回交后代單株，利用InDel標記In1和In2，按照PCR反應體系：PCR反應總體系50μl:cDNA模板2μl，10×buffer5μl，10mMdNTP2μl,10μM引物各3μl，高保真Taq酶1U。反應程序：預變性94℃4min；然后35個循環(huán)，變性95℃20s，58℃40s,72℃30s；再72℃延伸7min。將PCR產(chǎn)物通過1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，可分離出與抗褐飛虱親本SD和Ptb33一致的條帶來，In1擴增片段為355bp，見圖4；In2擴增片段為189bp，見圖5。均含有這兩個帶型的植株，即為選擇出來的含有Bph3或Bph3^p基因的抗褐飛虱單株。利 用基因標記InDel80可將水稻單株是含有Bph3，還是Bph3^p基因或是雜合完全區(qū)分開(見圖6)。通過接蟲鑒定可以對分子選擇效果進行確認(圖7)，在通過對水稻植株農(nóng)藝性狀加以選擇，便可培育抗褐飛虱水稻新品系或新品種。

本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所

<120> 一種水稻抗褐飛虱基因Bph3的等位變異及其基因標記應用

<130> 權利要求、說明書

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5587

<212> DNA

<213> 水稻Bph3等位突變基因

<400> 1

ttttaattta atttcaataa ttgattttaa ttattaaaat tattttcttt gctctgaaaa 60

ttccactaat aatcctctta atgtatttaa acatggagaa ctcaagaaaa atcccaccat 120

gctatttcca attattaatt gcatttatta atttgggttt agctcgaggt taaattgaat 180

tatttcttga ggcaatttat taattgaatt aaggctagaa aaagaggaaa cttcagggtg 240

tgacaatctg caatcttctc tagacatgct atacaattat tgtgttgcag tcaagccaat 300

acacatttct gcaatccgta tgatccatga agaatgaatg atatgagggt gtagataata 360

ccataaatta cagctaaaat gacattgctc tacaagttgg tgtggaagcc cttaactatt 420

gatgaaaatg ctgtcatgag aattagctac aaggtgatgg cagtcaaggc tagatcaagg 480

catgacaccc ttgttgccac cgccattagc taccagcgca acttccgtcg gcgaagtcat 540

accgttcttg gtgagatctg ggtgccccca tatcctttgt ctatcgcaca agaagctagg 600

caatgccttt gcaacctgct actgtcatgc tcggatgacg atgcagcaaa tgacagggag 660

aggatatctc taccgtgcca tgccggaatg ccttatcgtc gccggatatg ctagagccat 720

gaccgacatg gccttgtcac aaacacacca gagatgccag agccatggct aaagtcggag 780

ttgtcagtaa tgccaaaacc atgattgatg ataccttgcc gcaccaatgt caaagtcgca 840

accgtcctcc tcgacactgc attggaactg tggctggcac cagagacttc ggatccaagg 900

atccctaagt cattgagagg gaaggggtgg aggagaaaaa cgaagaagat agccatgctg 960

ccgtcttctt caagcctatc acaaacatac agtgtgcttg ggtagctgcg aggatggaga 1020

acaaggtgtg gtgacttaga tttctttcgc agggtggcaa atagggtttt tcgaactgac 1080

gagggactaa attgttttaa gattagaatg gctagggttt cacctttgtg caagaaagaa 1140

gatgccaagc tcttaacata tgtaagttta gaggtatgag tctagaacgc atacccttga 1200

tatgcaaaac gatgggatgg attagcacat agctaattaa gtattagcta aagcaactta 1260

aaaaattagt atgatttttt taaagcaatt ttatatagat ttttttaaaa tacacaccat 1320

ttagtagttg ggaagcatgc gtgtggaaaa cgatagaaga aaaagttggt aacgcctaca 1380

aaataacata agctaaagtg tttattacta aactaatcta ataaacataa gaaccaacca 1440

gctgttaaaa tgcttaatta cttaacgtgt ggtgaattga ttgcaaggct atttgacata 1500

tgcaacaaaa cttcaaggtt taactccaaa tctcgagtat tgtaatcaat aacccttgac 1560

aatcatggct gtcactaaca aagcactcgt ctcatggacc gatatccaat ccaacatttt 1620

tttaagccat ttaacaggga ttgaagttgt actaacttgt aagcttagcc aataaaaaag 1680

gactttgcac aatcaatgtc atactgtaaa cataatctga agtagagttt gccatctgtt 1740

ctgtcaaaga agcaagtatt tctagaagcc gtcttgacct aacgtggacc tgggggactt 1800

gaagacttct gcaacgcaag cttggaaagg actcaggaag tactgattcc aattgaccag 1860

ttaaatgttc aaaatatatg ttgctaccat ggtttcataa gagtttcatt ctgattaaat 1920

taaatacaga cagacatcat tagtcaatgt gtcctagctc cccttgaatg gagcactgac 1980

tttgcgtggt agaaatggct aaaacatata ttaggccatt tttagtgcag gtttcataag 2040

aggttttatt ctgattaaat taaatgccac atgggacatt gtcaaaaaaa ttatgaatag 2100

aaggaaggaa acaaaatcat ctatgtgaaa ctgtaatttg gaggtctata tgtttcatcc 2160

tatccgagct tatctagatt aggtgacttt tggaaacctc aaaatgaatc tcacagtagg 2220

aatggcctta cgatcagcaa agcaggttct gactgcgtca aaaaacctga tcaattaatg 2280

ttacagtgta ctcctatatt accatgaaaa gattacacct ggcttgacca taaccataca 2340

agctggccaa aactgttctt ctgaaacgcg gttggaaaga ccagcctcag gaggaacaaa 2400

acacagatag aaagacttct gaacacgtat ttctttctct ctccatgcag gtggtcaatg 2460

cattcaaagc cgacattttc tatagttttg ataaggaaat gtgaactaat ctccctctca 2520

tgtctatcat attgacagct ttgtaattgc atttgacagg ttcaaccgtt gcctcgcagg 2580

tcaaaaagtt gtatagagaa acttttggtt agtcaagtat ggaagtgatc aagactaaca 2640

aatgccgttc tccaagggct ataagttttg ttgtcatcaa gtatgagcaa aaggttgatc 2700

aatagcaatg gcacctatcc tgttcttgcc catcctgcaa atcttgctaa tatactgcac 2760

gaaatctgcc caagctcagc taaacatcag cataggctcc tctttgacac cccaggaggt 2820

aaacaactca tggatttcgc cctcttctga ttttgcattt ggttttcggg cggtagatgg 2880

aaactcctcg tcatacctgc tcgctgtctg gttcaacaag atcgctgaca agactgtcat 2940

ctggtacgca aagactagct ccaatgggca agatgataca ataccggtac aagtccaatc 3000

tggctctgtc ctcaagctcg ctgatggagc actctctctt cgtgatccat ctggcaatga 3060

ggtatggaat ccacgagtca ctgatgtggg ctatgctaga atgctcaaca ccggtaattt 3120

caggctttta ggcactgatg gcgcaacaaa gtgggagccc tttggtgacc cttctgatac 3180

catcctaccc acacaagtgc tcccactagg gacagcactc cacagccgtc tcctcgccac 3240

agactattcc aatggccggt ttcaactaaa tgttcaagat gacggtaatc ttgtgctgta 3300

tctagttgct gtaccttctg catactacca tgatccatac tgggccagta acacagtggg 3360

gaatggctca cagctggtgt tcaatgaaac tggaaggata tacttcacgc tgactaatgg 3420

ttcacagata aacatcactt ctgcaggagt ggactctatg ggtgatttct tccaccgtgc 3480

aacccttgat acagatggtg tgttccggca atatatttac ccaaagagca aacaggccag 3540

gagcttatgg caagagcaat ggagagcggt ggatgcactt ccggagaaca tctgccagac 3600

aattcaaaca aaggtaggca gtggtgcatg cggcttcaac agttactgta cctttgatgg 3660

caccaagaac acaacaaatt gtctatgccc acagaggtac aagttcttcg acaatgagag 3720

gacatacaaa ggttgcaggc cagattttga gccacaaagc tgtgatctag atgagacagc 3780

agcaatggtg cagtatgaga tgacaccaat tgatcgcatt aattggcctc tatctgacta 3840

tgagcagtac agcccgatag atgagaccga atgccgaagg ctgtgcgtca ttgattgctt 3900

ctgctccgtt gccgtgttca ataaaccctc aaacacttgt tataaaaaga agctcccttt 3960

atcaaatggg aatatgaatt ccagtttaca ggcgacagtt cttcttaagg tgcctaggag 4020

caccaattca ccatccatga tcagcagcgg ctccagcaaa tggaagaagg acaaaaagta 4080

ttggattctt gggagctcat tgttttttgg aagctctgta ttggtgaact ttctcctaat 4140

ctttgttctg ctttttggta cttattgtag tatcacctcg aggaagaaaa cccagttatc 4200

gcaactaccc agtaattctg gattaccttc aaagattttc acttacagag agctggaaaa 4260

ggcaaccggt ggtttccatg aggtacttgg tacaggagcc tcaggtattg tctacaaagg 4320

acagctgcaa gatgagtgtg gaactaacat cgcagtcaag aaaatcgaaa agcttcagca 4380

ggaagcacaa aaggagttct tggtggaagt ccaaaccatt gggcagacgt ttcacaggaa 4440

cttagttaga ctgcttggtt tttgcaatga gggaactgaa aagctgctag tgtatgagtt 4500

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<212> DNA

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<213> 水稻Rathu Heenati等位基因

<400> 3

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aaactgttct tctgaaacgc ggttggaaag accagcctca ggaggaacaa aacacagata 2400

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ccgacatttt ctatagtttt gataaggaaa tgtgaactaa tctccctctc atgtctatca 2520

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gcaagagcaa tggagagcgg tggatgcact tccggagaac atctgccaga caattcaaac 3600

aaaggtaggc agtggtgcat gcggcttcaa cagttactgt acctttgatg gcaccaagaa 3660

cacaacaaat tgtctatgcc cacagaggta caagttcttc gacaatgaga ggacatacaa 3720

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cagtaattct ggattacctt caaagatttt cacttacaga gagctggaaa aggcaaccgg 4260

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aaaggagttc ttggtggaag tccaaaccat tgggcagacg tttcacagga acttagttaa 4440

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agtagcactt ggggtttcac gaggactgct ctacctacat gaggagtgta ataaacaaat 4620

catccactgc gatatgaaac cacagaatat ccttctcgat gataattttg tagcaaagat 4680

ttcagatttt ggtctagcaa agcttcttcc ggtgaatcag acacaaacaa acaccggcat 4740

tcggggtact cgaggatatg ttgcacctga gtggttcaag aacataggga ttacttctaa 4800

ggtcgacgtt tatagctttg gagtgatcct gcttgagctt gtgtgctgca ggaagaatgt 4860

ggaattagaa gttgcagatg aggagcagac aatactaact tattgggcaa atgattgcta 4920

caggtgtggg aggattgact tgctggtggc gggcgatgac gaggcaatct tgaacataaa 4980

aaaggtggag cgctttgttg ctgtggcact gtggtgcctc caggaggagc catcgatgcg 5040

gccaacaatg cataaggtga tgcagatgct tgatggagca gtacaaatcc caacgcctcc 5100

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agattgtaat ttgaagcaat agcattcttt agactgatac ttcttcgata gggcttcgtg 5220

ttaaaggctt aaagcatgat atgagtcatg ttattcaggg cactcatgcc tgcctgcaac 5280

aaataatgtt tacatacgta tgaaagatta tgatacatga gctctgagcc tctgaatctg 5340

tttgagtcaa acattttctt actgaaatag atgactttaa atatgtttga tcatgaagta 5400

atattatctc ctctacaacc acatgatcct gcaattggaa atttggaatc aaataatcct 5460

tggctacttc ttatatgttc ttatactgaa agagtgtaca tatgttctta ccagcatatt 5520

tcacatttat aaaaaaaaca cctccttttt tctattagaa aggaaaagaa cagaaaa 5577

<210> 4

<211> 4221

<212> DNA

<213> Rathu Heenati的等位基因

<400> 4

gagtggcacg gctacgcata aatgaatgat aatggtattt atctgaacag acatatttgc 60

aatggcacag atcaaattaa cccatttttt agccatttaa cggggattga agttgtgcta 120

acttgtaagt aggggtgaaa ttcccggccg accgatgttc gtttcgactt tctaccagtt 180

gagccatatg gaaatggtaa tcgaccaaaa taaaaatgga aatggtaaaa aatatggaaa 240

tgaaaacgga aatggtttcg ctattatacc aatcgtttcc gtatttaccg tattcttgtg 300

gaaattaccg tttcttataa tatgataatt accgtattct aaatatatat ttataggaca 360

tgtctctact tacagattga ttgactcttc aatcaaatat ctaacttttg tgcatggcta 420

aaatggagtt aatttataat ttatattgta taagcttaaa tttatgtata catataacat 480

acttatgtaa agttaaatat atgtttttat agtttaatgt tttcgtattt aataccggtt 540

tccgatctgt accgacattc cgtccgtatt gttctgtttc cggttttccg atatttccaa 600

tatcgttttc gtttctgact ttaccgtttt caatttcgtt tccgagaaag gttacggaaa 660

tggttgaggc tgttttccga tcgtttccga ccgttttcat acctacttgt aagcttagcc 720

aataaaaaag gactttgcac aatcattgta cttaccgtaa acagaatctg aaatagagtt 780

tgccttctgt tctgtcaaag aagcaagtat tctagaagcc gtcttgacct aacgtggacc 840

agggagactt gaagacttct gcaacgcaag cttggaaagg actcaggagg tactgattcc 900

aattgaccag ttcaatgttc aaaataaatg ttgctacttg ctaccatggt ttcataagag 960

tttcattcta attaaattag atagacggac atcattagtc aatgtgtcct agctcccctt 1020

gaatggagca ctgacgttgc gtggtagaaa tggctaaaac ataaattagg ccatttttag 1080

tgcaggtttc atgcataaga gttttattct gattaaatta aatgccacag ggacattgtc 1140

aaaaaacaat accatctata tgaaactgta aattggaggt ctatatgttt catccattaa 1200

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tggccttacg atcagcaaag caggttctgg ctctgtcaaa aaaaacctga tcaattaatg 1320

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tggtcaaaac tgttcttctg aaacgcggta ggaaagacca gcaaggatca tgtcaggaga 1440

acccagcatg gttaatgcat tcaaagccga cattttctaa agttctgata atgaaatgtg 1500

aactaatcat attgacagct tggtaattgc ttttgacagg ttcaaccgtt gcctcacagg 1560

tctcaagact aacaaatgcc gttctccaag ggctataagt tttgttgtca tcagtacgag 1620

caaaaggttg atcaatagca atggctcatc tcctgttctt gcccatcctg caactcttgc 1680

tactatactg tacgaaatct gcccaagctc agctaaacat cagcataggc tcctctttga 1740

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gggcggtaga tggaaactcc tcctcttacc tgctcgccgt ctggttcaac aagatcgctg 1860

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acatctgcca gtcaatacaa acaatggtgg gtagtggagc atgcggcttt aacagttact 2580

gcaccattga tggcaccaag aacacgacaa gttgtttatg cccacagaac tataagttca 2640

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actttctcct aatctctgtt atgctttttg gtacttattg tagtatcacc tcgaggaaga 3120

aaatccagtt atcacaaccg tctaataact ctggattacc tccaaagatt ttcacttaca 3180

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