一種高效表達MicrocinJ25的工程菌株及其發酵工藝的制作方法

本發明涉及一種工程菌株以及針對該工程菌株的發酵工藝，具體涉及一種高效表達MicrocinJ25的工程菌株以及針對該工程菌株的MicrocinJ25發酵工藝，屬于基因工程
技術領域：
和發酵優化
技術領域：
。
背景技術：
：大腸桿菌容易產生耐藥性，由其引起的疾病給畜牧養殖造成了巨大損失，目前迫切需要解決這個問題。MicrocinJ25(MccJ25)是大腸桿菌素的縮寫，其表達菌是大腸桿菌。成熟的MccJ25是由21個氨基酸組成的套索肽，其中N端的第1個氨基酸至第8個氨基酸形成一個圓形環狀結構，第9個氨基酸至第21個氨基酸形成發夾結構，發夾結構貫穿圓形環狀結構，并通過非共價作用將這個尾部固定，理論上這個結構的理化性質非常穩定，能抵御強烈的變性條件，對溫度、蛋白酶、酸堿等有良好的耐受性。通過實驗驗證，MccJ25能耐受121℃高溫高壓，模擬胃腸液處理后仍具有活性，可見MccJ25適合工業放大生產，并能到達動物腸道后端發揮作用。此外，通過體外抑菌實驗發現，MccJ25能殺滅多種致病性大腸桿菌。綜上，MccJ25可作為飼料添加劑使用，并具有開發為新獸藥的潛力。MccJ25的表達菌是大腸桿菌，但是MccJ25野生基因簇的表達在實際應用中受限，主要體現在以下幾方面：一、MccJ25野生基因簇的表達對有機氮源有較強的選擇性，而有機氮是發酵成本的主要占用者。二、MccJ25的表達受鐵離子影響較大，雖然可以通過加入螯合劑減輕鐵離子的影響，但工業生產的各個環節均可產生鐵離子，最終將導致加入的螯合劑超標，抑制菌體生長，因此工業生產中除鐵不適用。三、現代追求高密度發酵，曲線的方式提高目標產物表達量，MccJ25野生基因簇的表達不依賴于細胞密度，但強烈依賴菌體生長狀態，在平臺期后期大量表達，不適合高密度發酵。四、工業生產追求穩定、高效和低成本，MccJ25野生基因簇的上述特點極易導致生產水平波動，造成生產成本提高。綜上，有必要發展一套不依賴于氮源和生長狀態的表達系統來表達MccJ25。目前，大腸桿菌商業化表達系統主要涉及單基因、單載體誘導表達，不適合多基因、多載體協同表達。合成生物學是近年發展起來的針對多基因協同表達技術，它結合生物信息手段，利用標準的生物學原件，例如啟動子、核糖體結合位點(RBS)、終止子等，控制多基因的協同表達。中心法則已闡明，基因轉錄成mRNA，再翻譯成蛋白質。這個過程受到各種調控，例如DNA甲基化、乙酰化、小RNA、啟動子強度、RBS翻譯效率、酶的濃度和活性、分裂周期等。對于大腸桿菌而言，啟動子、RBS、酶濃度和細菌生長狀態是影響目標蛋白表達量的主要因素。本發明擬結合傳統生物技術和合成生物學的理論及提供的信息，利用大腸桿菌作為宿主菌，高效表達MccJ25。技術實現要素：本發明的第一個目的在于提供一種高效表達MccJ25的工程菌株。本發明的第二個目的在于提供一種針對上述工程菌株的MccJ25發酵工藝。為了實現上述兩個目標，本發明采用如下的技術方案：一種高效表達MicrocinJ25的工程菌株，其特征在于，通過下述方法構建而成：分別將MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因構建到2個質粒中，轉化大腸桿菌MC41OO，從而產生出一株高效表達MicrocinJ25的工程菌，該工程菌已于2016年08月23日保藏在了中國普通微生物菌種保藏中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo.12902，分類名稱為大腸埃希氏菌Escherichiacoli。一種利用前述的高效表達MicrocinJ25的工程菌株發酵生產MicrocinJ25的工藝，其特征在于，包括以下步驟：Step1：準備種子罐，罐內培養基的組成為10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+2g/L磷酸二氫鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH≥6.2；Step2：將菌種接種于種子罐內，進行擴大培養；Step3：準備發酵罐，罐內培養基的組成為10g/L蔗糖+50g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH6.2-6.5；Step4：將種液接種于發酵罐內，進行發酵培養。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養的條件為：35℃-37℃，120rpm，通氣20m3/h。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養的時間為：8-10h。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養過程中適當調整培養基的pH值，使pH≤7.0。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養的條件為：35℃-37℃，80rpm，通氣200m3/h。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養的時間為：17-19h。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養過程中前12h控制培養基的pH≤7.0。本發明的有益之處在于：(1)本發明通過對MccJ25野生型基因簇進行改造，使McjABCD基因位于不同質粒并轉化大腸桿菌MC4100所構建的工程菌株能夠高效表達MccJ25，實驗室50L罐表達量達到600mg/L以上水平，工業生產30T罐表達量達到500mg/L水平。(2)發酵工藝：通過調整培養基碳氮源比例和發酵過程溶氧、pH等參數，獲得了最優發酵效果，經上述工藝工程菌株能夠高效表達MicrocinJ25，1T罐表達量達到600mg/L，30T罐表達量達到500mg/L，改善生產環境和設備后30T罐表達量達到600mg/L，現已是正常的生產水平。附圖說明圖1是DAB顯色結果圖；圖2是化學發光顯色結果圖；圖3是不同宿主菌中質粒pACYCJ252的表達量圖；具體實施方式以下結合附圖和具體實施例對本發明作具體的介紹。第一部分：構建高效表達MicrocinJ25的工程菌株該工程菌株通過下述方法構建而成：分別將MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因構建到2個質粒中，轉化大腸桿菌MC41OO，從而產生出一株高效表達MicrocinJ25的工程菌。下面詳細介紹該工程菌株的構建過程。一、全基因合成MicrocinJ25基因簇根據文獻報道，參考NCBI基因庫中的序列JX077110(MicrocinJ25基因簇序列包含于此序列)，全基因合成MicrocinJ25基因簇。經重新測序，所合成的MicrocinJ25基因簇的序列為SEQIDNO:1。結論：所合成的MicrocinJ25基因簇序列完全正確。將合成的MicrocinJ25基因構建到常規載體中，看其是否表達；另外，將合成的MicrocinJ25基因作為后續研究的基因材料。二、構建表達載體采用分子克隆常規方法，將McjA基因、McjB基因、McjC基因、McjD基因分別與GFP融合，通過WesternBlot測定各基因的表達強度。DAB顯色結果見圖1。DAB顯色法只檢測到了“A-GFP”融合蛋白表達，表明McjA基因的表達量遠遠高于McjB基因、McjC基因和McjD基因。化學發光顯色結果見圖2。根據GFP標準品的含量，估算出McjB基因、McjC基因和McjD基因的表達量分別為0.76mg/L、0.97mg/L、0.39mg/L。基于此，我們設計構建BCD基因組成型表達載體和最優RBS+A基因組成型表達載體兩種載體。1、構建BCD基因組成型表達載體(1)引物引物編號引物序列840f5’-CTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAATTGAGTGTAAAGGCATAA-3’840f15’-AGGGGATCCTCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGT-3’534r5’-TGACTGTTTTATTGTATTCACTAG-3’(2)啟動子啟動子來源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)。通過比較相對活性，我們最終確定的最優啟動子為：aattctctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagtcagggtaag(編號為BBa_M13110，相對活性達到0.91)。(3)構建BCD基因組成型表達載體用編號為840f、840f1、534r的引物將啟動子BBa_M13110同McjB基因、McjC基因、McjD基因拼接，BamHI/SpeI雙切后插入質粒pACYCJ252相應的酶切位點中，構建BCD基因組成型表達載體，記為載體pDZ138。質粒pACYCJ252的構建方法如下：MicrocinJ25插入到pACYC177載體的BamHI和SphI酶切位點中，即得到pACYCJ252載體。2、構建最優RBS+A基因組成型表達載體(1)設計RBS根據網站(https://www.denovodna.com/software/)預測不同翻譯起始效率的RBS，由引物公司合成。以合成的RBS作為上游引物，下游引物為738r(5’-CTCGTCGACGCCATAGAAAGATATAGGT-3’)，反應體系(50μL)為：反應buffer10μL、2.5mMdNTPs4μL、上下游引物各1μL、phusionDNA聚合酶0.5μL、模板pACYCJ2521μL和無菌水32.5μL。反應結束后切膠回收，BglII/SalI雙切后插入質粒pDZ130(含有野生McjA基因的質粒)相應位點中，轉化大腸桿菌DH5α菌株，挑取陽性克隆，測序驗證序列，質粒以pDZ13xx命名。將質粒pDZ13xx同質粒pACYCJ252共轉大腸桿菌DH5α菌株，氨芐青霉素和卡那霉素雙卡選擇，挑取單克隆提質粒酶切鑒定，陽性克隆用于RBS篩選。陽性克隆劃線氨芐青霉素、卡那霉素雙抗平板，37℃過夜培養，第二天挑單克隆于10ml試管中，裝3mlLB，37℃、220rpm震蕩培養12h，1％接種于250ml三角瓶中，裝50mlLB，37℃、220rpm震蕩培養20-24h，取上清進行HPLC測定。預測的RBS序列及其翻譯起始效率以及HPLC測定結果見下表：測定結果表明：質粒pDZ1307表達量略高于質粒pDZ130，但是菌體生長滯后，不利于發酵工作；質粒pDZ1314、質粒pDZ1335和質粒pDZ1340菌體生長不良，主要表現為轉化難生長，轉化成功克隆OD值偏低，推測原因是它們的RBS結合能力較強，使包內RBS水平不足，干擾了其他代謝基因的表達。綜合考慮，我們最終選擇質粒pDZ130的RBS開展后續工作，最優RBS的序列為：TTCCATCAAATAAGGAACGTAAAAAGATCTACGAGAAAAAATAGCCCGCATAAGGAGGTCCCCA(859f)。(2)啟動子對來源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)的40個啟動子對數期活性與啟動子J23101(gatccgctagcataatacctaggactgagctagctgtaaag)比較，得到相對啟動子活性(RPU)強弱排序，詳見下表。在表中：由上到下，由左到右，RPU依次降低，其中高于啟動子J23101的啟動子有3個(啟動子J8990、啟動子J2930、啟動子J8586)，其余均低于它。我們最終確定啟動子J8990為最優啟動子，其序列為：Gatccgctagcattatacctaggactgagctagctgtcaag。(3)引物935f：5’-AGCGGATCCACAGAAGGACGTGAGGT-3’835r：5’-ATAGAGCTCTTAACCGTAGAAACTGA-3’(4)構建最優RBS+A基因組成型表達載體以質粒pDZ130為模板擴增最優RBS+A基因，BamHI/SacI雙切后插入質粒pDZ174中，啟動子BBa_J8990插入質粒pDZ174的EcoRI/BamHI位點，構建最優RBS+A基因組成型表達載體，記為載體pDZ177。3、驗證表達載體PCR反應體系：PCR反應程序：98℃×1min，98℃×15s、55℃×20s、72℃×30s，重復30個循環，72℃×2min。電泳檢測，切膠回收連接載體。酶切反應體系：連接反應體系：連接反應條件：22℃反應1h，轉化大腸桿菌DH5α菌株。挑取單克隆，提質粒測序驗證，驗證結果顯示：BCD基因組成型表達載體和最優RBS+A基因組成型表達載體均構建成功。三、雙質粒電轉化感受態細胞1、篩選最佳宿主菌我們將單質粒pACYCJ252分別轉化到大腸桿菌DH5α菌株、MG1655菌株、MC4100菌株、MC1061菌株、BL21菌株、JM109菌株、TOP10菌株和AB1133菌株中，相同條件下培養相同時間后，分別檢測不同宿主菌中質粒pACYCJ252的表達量，檢測結果見圖3。所以，我們最終確定大腸桿菌MC4100菌株為最佳的宿主菌。2、雙質粒電轉化大腸桿菌MC4100菌株將構建成功的BCD基因組成型表達載體(即載體pDZ138)和最優RBS+A基因組成型表達載體(即載體pDZ177)共轉到感受態細胞-大腸桿菌MC4100菌株中，具體的步驟為：(1)50ml宿主菌培養液(OD600≈0.2-0.3)倒入50ml離心管，冰浴10min；4℃，6000g離心8min；棄上清，加入50ml預冷無菌水，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；棄上清，加入40ml預冷10％甘油，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；加入30ml預冷10％甘油，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；棄上清，加入500μl預冷10％甘油，吹打均勻，90μl每管進行分裝；(2)根據質粒濃度，將兩種質粒(載體pDZ138和載體pDZ177)加入到感受態細胞中，1200v電壓進行電擊轉化；(3)加入900ulLB培養基，37℃復蘇培養1h，4000rpm離心3min，涂抗性平板；(4)次日挑取單克隆到LB中培養，提質粒，酶切鑒定。鑒定結論：雙質粒成功電轉化到了大腸桿菌MC4100菌株中。3、用氨芐青霉素和卡那青霉素雙抗篩選BCD基因組成型表達載體(載體pDZ138)：氨芐青霉素抗性最優RBS+A基因組成型表達載體(載體pDZ177)：卡那霉素抗性用氨芐青霉素和卡那霉素雙抗篩選菌株。4、HPLC檢測MccJ25表達量將鑒定正確菌株過夜活化，次日轉接到50ml培養基中，每種菌3個平行。37℃培養20-24h，各取1ml，12000rpm離心3min，取上清。用0.22um濾膜過濾上清，置于高效液相色譜儀進樣瓶，檢測。檢測結果見見下表：載體pDZ171+載體pDZ138載體pDZ177+載體pDZ1381#2802652#2463843#218403平均2483516、小結將外源基因插入載體中進行表達是現有技術，外源基因要有啟動子啟動轉錄，終止子終止轉錄，核糖體結合位點啟示翻譯。在本發明中，我們將MicrocinJ25基因簇自身誘導型啟動子替換為不受外界條件限制的組成型啟動子，而且啟動活性是在所篩選啟動子中活性最高。同時，本發明也對McjA的RBS區進行了優化，提高了翻譯效率，進而提高J25表達量。復制子不同質粒共轉同一宿主菌是現有技術，本發明中將McjA構建到高拷貝質粒中，其復制子為ColE1，McjB+McjC+McjD構建到低拷貝質粒中，其復制子為p15A。共轉方法有化學轉化和電擊轉化，為提高轉化效率，本發明采用電擊方法進行轉化。本發明中所用到載體骨架均來自常規基因工程載體，根據實驗中對拷貝數要求和載體抗性而進行改造。本發明所用宿主可以為常用克隆和表達大腸桿菌宿主，通過共轉后檢測MicrocinJ25表達量，選擇最優作為本發明宿主，即MC4100。2016年08月23日，我們將構建成功的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo.12902，分類名稱為大腸埃希氏菌Escherichiacoli。第二部分：工程菌株發酵條件的優化一、實驗方法實驗1：挑取菌株(保藏編號CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養12-16小時，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養基50ml)于37℃、220rpm培養24小時，取適量培養液離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達量。實驗2：挑取菌株(保藏編號CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養12-16小時，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養基50ml)于37℃、220rpm培養8-10小時，火焰接種法接入發酵罐中，在發酵過程中每隔一定時間取樣，離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達量。實驗3：挑取菌株(保藏編號CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養12-16小時，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養基50ml)于37℃、220rpm培養8-10小時，火焰接種法接入1噸種子罐中，種子罐培養6-8h，移種入30噸發酵罐，在發酵過程中每隔一定時間取樣，離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達量。二、碳源篩選試驗結果表明：(1)葡萄糖、果糖作碳源會使培養基迅速酸化，沒有表達量；(2)甘油作為培養大腸桿菌(特別是工程菌)常用碳源在本實驗中不適用，沒有表達量；(3)蔗糖在比較中表現出優勢。三、氮源篩選試驗結果表明：有機氮源較無機氮源更有利于菌體生產，無機氮源培養菌體生長很差，酵母浸粉是最適合氮源。四、適合菌體生長碳氮比試驗結果表明：隨著碳氮比的下降，生物量逐漸上升后下降，但是MccJ25的表達量逐漸上升，這表明生物量與MccJ25表達量之間存在非線性關系，MccJ25表達需要一定的生物量但是生物量與表達量之間存在相互影響關系，應以MccJ25表達量作為主要評價指標。五、利于MccJ25表達碳氮比試驗結果表明：適合的碳氮組合為10g/L蔗糖，40g/L酵母浸粉，搖瓶表達量可達235mg/L，以此為發酵培養基培養表達MccJ25培養基。六、發酵罐培養條件優化試驗結果顯示：10L罐培養的適合培養條件為37℃，0.4m3/h通氣和250rpm。以此培養基和培養條件對通過基因改造后對鐵離子和酵母浸粉不敏感的雙質粒工程菌(保藏編號CGMCCNo.12902)作進一步的優化試驗。七、發酵罐培養過程控制pH培養和實驗室放大試驗室在10L罐和50L罐培養表達MccJ25表達量都在600mg/l以上，最高可達700mg/l以上，達到預定目標，以此參數為依據，可以進行中試生產。八、中試生產條件及結果經驗證，本發明所構建的工程菌株能夠高效表達MicrocinJ25，1T罐表達量達到600mg/L，30T罐表達量達到500mg/L，改善生產環境和設備后30T罐表達量達到600mg/L以上將是正常的生產水平。九、總結最優發酵條件種子培養基的組成為：10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+2g/L磷酸二氫鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH≥6.2。種子培養的條件為：在35℃-37℃、120rpm、通氣20m3/h條件下培養8-10h，培養過程中適當調整培養基的pH值，使pH≤7.0。發酵培養基的組成為：10g/l蔗糖+50g/l酵母浸粉+3g/l磷酸氫二鉀+0.5g/l硫酸鎂，初始pH6.2-6.5。發酵培養的條件為：在35℃-37℃、80rpm、通氣200m3/h條件下培養17-19h，培養過程中前12h控制培養基的pH≤7.0。綜上所述，本發明所構建的工程菌株能夠高效表達MicrocinJ25，在實驗室中30T罐表達量達到600mg/L以上，在工業生產中30T罐表達量達到500mg/L以上，改善生產環境和設備后30T罐表達量可以達到600mg/L，具有非常積極的推廣應用價值。需要說明的是，上述實施例不以任何形式限制本發明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護范圍內。SEQUENCELISTING<110>****（申請人名稱）<120>一種高效表達MicrocinJ25的工程菌株及其發酵工藝<160>1<210>1<211>4440<212>DNA<213><220><221><222><400>1TCAGAATATCAGCCATAGAAAGATATAGGTGTACCAATCCCCACAAAATACTCAGGCACATGTCCTGCACCACCTTTTGTGAGTTGCGATGCTGATTTTT100TTATTTGTATAACCCCCTTTGCAGGAGATGGAACATTATTTTTTTTACCAGAAGACAGTTTATTAAAATGAAAATGCTTAATCATTTTTACGTTCCTTAT200TTGATGAAAATAGTATGATGATTTTTACAGAGGAACCTCACGTCCTTCTGTTAGAATTTTATTAGCACAAAATAAAATTGAGATCAATAATCATTACGCT300TTAGTAATTTATCAATAAAATTATTTAGATACAAACATCCATAAACTAATCAATCTGCAAAAGTGGTCAAATTTAGTACAATATTTTGGATTTTTATACA400TTTTTCTAATTATTTCAGAATATTTAGCCATCAATTAAGAAAAAAATTTAGCTTGTAGATAAATTCAGAAGTTTTATTATTCCAATTGAGTGTAAAGGCA500TAACTACAGGAGGGAGTGTGCAAAATGATCCGTTACTGCTTAACCAGTTATAGAGAGGATCTTGTTATCCTGGATATAATTAATGATAGTTTCAGCATAG600TGCCTGACGCAGGTAGCTTGCTAAAAGAAAGAGATAAATTGCTTAAAGAATTCCCACAACTATCTTACTTTTTTGACAGTGAATATCATATTGGAAGTGT700TTCTCGTAATAGTGACACTTCTTTTCTTGAAGAACGCTGGTTTCTACCAGAACCTGACAAAACATTATATAAGTGTTCTCTATTTAAACGATTTATATTA800TTACTCAAAGTCTTTTACTATAGCTGGAATATTGAAAAAAAAGGGATGGCATGGATTTTCATAAGTAATAAAAAAGAGAATAGGCTATACTCCTTGAATG900AAGAGCATCTTATCCGGAAAGAAATTAGTAATCTTTCCATTATCTTTCATCTTAATATTTTTAAATCTGACTGTCTTACCTATTCATACGCACTAAAAAG1000AATTCTTAATTCCAGAAATATTGATGCTCATCTTGTTATTGGTGTAAGGACACAACCTTTTTATAGCCACTCTTGGGTGGAGGTTGGGGGACAAGTTATC1100AATGATGCTCCCAATATGCGGGATAAATTATCTGTTATTGCAGAGATATAGTTATGGAAATATTTAATGTCAAGTTAAATGATACTTCAATTAGAATTAT1200TTTCTGTAAAACGCTTTCTGCCTTCCGGACAGAAAATACCATCGTTATGCTCAAAGGAAAAGCAGTTTCAAATGGCAAACCTGTATCCACAGAGGAGATT1300GCCAGAGTAGTGGAAGAAAAAGGTGTTTCAGAAGTAATAGAAAATTTAGATGGTGTTTTCTGTATCCTAATTTATCATTTTAATGATCTCCTTATAGGGA1400AAAGCATTCAATCAGGCCCCGCTCTATTTTATTGTAAAAAGAATATGGATATTTTTGTTTCGGATAAAATTTCTGATATCAAATTTTTGAATCCAGATAT1500GACATTCAGTCTAAATATAAAAATGGCAGAACATTATCTGTCAGGAAATCGAATAGCAACCCAGGAATCACTAATCACTGGCATTTACAAAGTAAATAAT1600GGTGAGTTTATAAAATTTAATAATCAGTTGAAACCTGTGCTACTTCGTGATGAGTTTAGTATTACCAAAAAGAACAATTCAACTATCGACAGTATCATTG1700ATAATATTGAGATGATGCGGGATAATAGAAAAATAGCCCTATTATTCTCCGGAGGATTGGATTCTGCATTAATTTTTCACACACTTAAAGAATCAGGTAA1800CAAATTCTGCGCTTATCATTTTTTTTCTGATGAATCTGATGACAGTGAAAAGTATTTTGCTAAGGAATACTGTTCAAAATATGGAGTTGATTTTATATCT1900GTTAATAAAAACATCAACTTTAATGAAAAACTTTATTTCAATTTAAATCCTAATAGTCCGGACGAAATCCCTTTGATATTTGAACAGACAGATGAAGAAG2000GTGAAGGTCAGCCCCCCATAGACGATGATTTATTATATCTATGTGGTCACGGTGGAGATCATATTTTCGGACAAAATCCTTCAGAACTTTTTGGCATTGA2100TGCATATCGAAGTCATGGCTTGATGTTTATGCATAAAAAAATAGTAGAATTTTCCAATCTCAAGGGAAAGAGATATAAAGATATCATATTTTCAAATATT2200TCCGCATTCATTAATACATCCAACGGATGTTCTCCAGCAAAGCAAGAGCACGTATCAGATATGAAACTTGCCTCTGCTCAGTTTTTTGCAACTGATTATA2300CAGGAAAAATTAATAAACTAACTCCATTCCTGCATAAAAATATTATCCAGCATTATGCTGGCTTACCAGTTTTTAGTCTATTTAACCAGCACTTTGATCG2400TTATCCCGTTCGTTATGAAGCGTTTCAACGATTTGGTTCAGATATTTTCTGGAAAAAAACCAAACGGTCATCTTCACAGCTAATATTCAGAATTCTATCC2500GGTAAAAAGGATGAACTAGTGAATACAATAAAACAGTCAGGATTAATTGAAATATTAGGCATTAACCATATTGAATTAGAAAGCATTTTGTATGAAAATA2600CGACTACACGTCTGACAACGGAACTACCATATATACTTAACTTATACCGTCTGGCAAAATTCATTCAACTTCAATCCATTGATTATAAAGGTTAATTATG2700GAAAGAAAACAGAAAAACTCATTATTTAATTATATTTATTCATTAATGGATGCAAGAGGTAAATTTTTATTCTTTTCCATGTTATTCATTACATCATTAT2800CATCGATAATCATATCTATTTCACCATTGATTCTTGCAAAGATTACAGATTTACTGTCTGGCTCATTGTCAAATTTTAGTTATGAATATCTGGTTTTACT2900TGCCTGTTTATACATGTTTTGCGTTATATCTAATAAAGCAAGTGTTTTTTTATTTATGATACTGCAAAGTAGTCTACGTATTAACATGCAGAAAAAAATG3000TCGCTAAAATATTTGAGAGAATTGTATAACGAAAATATAACTAACTTGAGTAAAAATAATGCTGGATATACAACGCAAAGTCTTAACCAGGCTTCAAATG3100ACATTTATATTCTTGTGAGAAATGTTTCCCAGAATATCCTGTCACCTGTTATACAACTTATTTCTACTATTGTTGTTGTTTTATCTACGAAGGACTGGTT3200TTCTGCCGGTGTGTTTTTTCTCTATATTCTGGTATTTGTAATTTTTAATACCAGACTGACTGGCAGTTTAGCGTCACTCAGAAAACACAGCATGGATATC3300ACTCTTAACTCTTATAGTCTGTTATCTGATACTGTTGATAACATGATAGCAGCTAAAAAGAATAATGCATTAAGACTTATTTCTGAACGTTATGAAGATG3400CTCTCACTCAGGAAAACAATGCTCAGAAAAAATACTGGTTACTCAGTTCTAAAGTTCTTTTATTGAACTCTTTACTTGCTGTAATATTATTTGGTTCTGT3500ATTCATATATAATATTTTAGGTGTGCTGAATGGTGTAGTTAGTATCGGCCACTTCATTATGATTACATCATATATCATTCTTCTTTCAACGCCAGTGGAA3600AATATAGGGGCATTGCTAAGTGAGATCAGGCAGTCAATGTCTAGCCTGGCAGGTTTTATTCAACGTCATGCCGAGAATAAAGCCACATCTCCTTCAATAC3700CTTTTCTCAACATGGAGCGAAAATTAAACCTGTCCATAAGAGAGCTTTCATTTAGCTATAGTGATGATAAAAAAATACTTAATTCAGTCAGTCTTGACCT3800TTTTACCGGAAAAATGTATTCATTAACCGGACCCAGTGGTTCAGGAAAATCCACCCTTGTAAAAATAATATCAGGTTACTATAAAAATTACTTTGGAGAC3900ATTTATCTGAATGATATATCCTTACGTAATATCAGTGATGAGGATTTGAATGATGCTATTTACTACCTAACACAAGATGATTATATTTTTATGGATACAC4000TACGATTTAATCTCCGGCTCGCAAATTACGACGCGTCAGAAAATGAAATGTTTAAAGTTCTTAAACTGGCAAATCTTTCTGTCGTCAACAATGAACCAGT4100GAGTCTGGATACACACCTTATAAACAGAGGCAATAACTATTCAGGAGGGCAAAAACAACGAATTTCGTTAGCGCGACTGTTTTTGAGAAAACCTGCAATA4200ATTATTATTGATGAAGCCACATCGGCTCTGGATTATATTAATGAATCAGAAATTTTATCATCAATAAGAACTCATTTTCCTGATGCGTTAATTATAAATA4300TTAGTCACCGAATAAATCTTCTGGAGTGTTCCGATTGTGTTTATGTATTGAATGAAGGAAATATTGTTGCTTCTGGCCATTTCAGGGATTTGATGGTCAG4400CAATGAATACATATCGGGACTGGCTTCTGTTACTGAATAA4440當前第1頁1 2 3