一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法與流程

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

背景技術：

生物被膜又稱生物膜(biofilm)是在生物或非生物介質表面由微生物及其胞外基質(Extracellular polymeric substance,EPS)形成的致密、復雜的生物聚集體。EPS作為生物膜的主要組成物質，對保持生物膜的結構和功能的完整性、代謝物質傳質通道順暢具有重要作用。EPS是細胞在固體介質誘導下自主合成的富含大分子多糖的胞外結構，具有良好的持水性、溶脹性、透過性，能夠穩定細胞表面的水化層、及時泵出細胞的反應物、為細胞創造有益的微環境，可認為是生物相容性最佳的固定介質。同時，EPS為細胞隔離外界毒性物質提供了一道天然屏障，因而提高了EPS中微生物細胞的抗逆能力。因此，細胞在EPS中能夠大量增殖形成密集的菌群進而展示集群效應。集群效應可使群體成員實現生理協同作用，借助個體間的互相刺激而使個體的行為、生理、形態發生變化，使多個生物個體在行為上相互協作，從而提高整個種群的代謝及適存能力。

在臨床醫學領域，超過80％的慢性感染疾病都與體內細菌形成EPS有關，而細菌形成EPS后對抗生素等殺菌劑和宿主免疫系統的敏感性顯著降低，因此，大部分有關EPS機理的研究都集中在如何清除人體器官及外源性生物植入材料表面上的EPS。然而，作為EPS的另一種存在形式——固定化發酵過程中細胞形成的EPS卻至今鮮有研究，尤其是固定化細胞形成EPS后表現出的較高底物耐受性和較快的發酵效率的機制機理到現在還不是很清楚。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

本發明還要解決的技術問題是提供利用調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法構建得到的丙酮丁醇基因工程菌。

本發明最后要解決的技術問題是提供利用上述基因工程菌在EPS催化體系中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法，該方法是利用二型內含子基因敲除技術在丙酮丁醇梭菌的Spo0A基因中插入內含子序列。在Spo0A基因中插入內含子序列，最終使Spo0A基因不能正常表達，從而引起丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)的合成。

其中，所述的丙酮丁醇梭菌保藏編號為CGMCC No.5234，該菌株的具體信息在申請號為201210075094.X的中國專利中詳細公開。

其中，所述的Spo0A基因為CA_C2071，其核苷酸序列如SEQ ID No.：1所示。Spo0A基因編碼一種孢子生成蛋白，在發育早期通過多組分磷酸化途徑而被激活，是雙組份應答性調節蛋白大家族的成員之一，調控并起始孢子形成作用所需基因的轉錄。

其中，利用二型內含子基因敲除技術將SEQ ID No.：2所示的內含子序列插入Spo0A基因的第242bp和第243bp之間

其中，所述二型內含子基因敲除技術的操作方法如下：

(1)分析SEQ ID No：1所示的序列，得到內含子的核苷酸序列和基因的插入位點；

(2)內含子序列構建到二型內含子基因敲除質粒中，得到重組質粒；

(3)將步驟(2)得到的重組質粒轉化丙酮丁醇梭菌，篩選得到Spo0A基因失活的菌株

其中，所述的所述二型內含子基因敲除質粒為PMTL007C-E2質粒，該質粒的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

上述調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法構建得到的丙酮丁醇基因工程菌。

上述丙酮丁醇基因工程菌在發酵生產丙酮丁醇中的應用。

有益效果：

(1)本發明將丙酮丁醇梭菌B3中Spo0A基因進行插入失活后，使得此基因不能正常表達，獲得CA_C2071基因插入失活的重組菌株。

(2)本發明提供了一種簡單、高效的調控EPS合成的方法，借助此方法得到的重組菌株對EPS具有較高的調控作用，當以葡萄糖為碳源，在100ml厭氧瓶中利用載玻片生物膜培養法培養丙丁菌生物膜時，生物膜厚度為5.81μm，而同等條件培養的出發菌株生物膜厚度達到24.6μm。

附圖說明

圖1為本發明二型內含子基因敲除質粒PMTL007C-E2的質粒圖譜。

圖2為本發明使用二型內含子插入失活的機理圖。

圖3為轉化子菌落PCR電泳圖，泳道1：出發菌基因組驗證PCR產物(846bp)；泳道2-23為挑取的紅霉素抗性單菌落的菌液作為模板驗證PCR產物(2755bp)；泳道M：DNA Marker DL2000。

圖4為自制反應器中細胞固定化材料的填裝方法圖。

圖5為出發菌與敲除菌EPS宏觀形態圖。(在不銹鋼反應器中，固定化材料與不銹鋼絲網交替纏繞呈圓柱狀，我們定義固定化材料靠近罐壁的一面為正面，另一面為反面反面。)

圖6為CLSM觀察出發菌與敲除菌EPS形成過程圖。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1：丙酮丁醇梭菌CA_C2071基因失活突變株的構建方法。

1、設計內含子：

根據NCBI數據庫收錄的丙酮丁醇梭菌的CA_C2071基因序列(如SEQ ID No：1所示)，借助軟件設計合適的插入基因位點(http://www.clostron.com)，選擇插入在第242-243個堿基之間，并生成內含子序列，合成內含子序列S-242其序列如SEQ ID NO：2所示。

2、CA_C2071插入失活載體的構建：

用XhoⅠ和BsrGⅠ雙酶切載體PMTL007C-E2，其序列如SEQ ID NO：5所示。酶切產物經純化試劑盒(Takara)化后，與內含子序列S-242通過一步克隆(ClonExpress)連接。將一步克隆連接的重組質粒轉化到大腸桿菌E.coli DH5a(本實驗室)，涂布到含有25ug/ml氯霉素抗性LB平板，37℃培養12-16h，挑取轉化子，接到液體含有25ug/ml氯霉素LB培養基中，37℃、200rpm培養12h，提取重組質粒(AXYGEN)，測序驗證,獲得CA_C2071插入失活載體PMTL007C-E2-2071。

3、載體PMTL007C-E2-2071甲基化：

由于已經證明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutlicum)ATCC 824中含有限制性內切酶Cac824I，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在對丙酮丁醇梭菌進行轉化前對重組失活載體PMTL007C-E2-2071進行甲基化修飾。具體操作步驟為制備E.coli Top 10/pAN2(本實驗室)的化學感受態，將測序成功的失活載體轉化到大腸桿菌E.coli Top 10，由于pAN2質粒具有四環素抗性，故涂布到含有25ug/ml氯霉素和10ug/ml四環素雙抗性LB平板，37℃培養12-16h，挑取轉化子，接到液體含有25ug/ml氯霉素和10ug/ml四環素LB培養基中，37℃、200rpm培養12h，提取甲基化缺失載體(pAN2質粒含有一個枯草芽孢桿菌噬菌體基因，能編碼甲基轉移酶，能實現外源質粒在大腸桿菌中的甲基化)。

4、電轉化甲基化的敲除質粒至丙酮丁醇梭菌：

厭氧條件下，取2xYTG培養基培養的生長至對數中期的C.acetobutylicumB3培養液60ml，4℃、4000rpm離心10min棄去上清，加入足量預冷的電轉緩沖液EPB(270mM蔗糖，5mMNaH₂PO₄，pH7.4)，洗滌兩次，并用2.3mlEPB重懸。然后取570ul加入0.4cm電轉杯放置在冰浴中冷卻，并加入20ul甲基化質粒，冰浴放置2min。2.0kV電壓，25uF電容進行電轉化。隨后將電轉液加入到1ml37℃的2xYTG培養基中復蘇培養4h，離心收集細胞100ul并將細胞涂布于含有20ug/ml甲砜霉素的P2平板中。厭氧培養24-36h后。

5、篩選CA_C2071插入失活突變株：

挑取轉化子，使用引物CA_C2071-T-F(其序列如SEQ ID NO：3所示)和CA_C2071-T-R(其序列如SEQ ID NO：4所示)，對轉化子進行菌落PCR驗證，篩選出內含子插入基因組的突變株(插入后，PCR擴增出基因條帶電泳圖上比野生型大約1Kbp)。將正確插入的突變株傳代三次，同時涂布在含有紅霉素抗性和紅霉素、甲砜霉素抗性的P2固體培養基上，篩選出敲除質粒丟失的突變株(在同時含紅霉素和甲砜霉素抗性平板上不能生長的突變株)。

實施例2：敲除菌與出發菌分別在2L發酵罐中固定化發酵合成胞外聚合物(EPS)的工藝。

平板培養基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸銨2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，七水合硫酸亞鐵0.1g/L，瓊脂15g/L，其余為水。

種子培養基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸銨2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，七水合硫酸亞鐵0.1g/L，其余為水。

發酵培養基：葡萄糖60g/L，乙酸銨2.2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，氯化鈉0.01g/L，七水合硫酸鎂0.2g/L，七水合硫酸亞鐵0.01g/L，一水合硫酸錳0.01g/L，其余為水。

將實施例1中構建的CA_C2071基因插入失活的丙酮丁醇梭菌重組菌和出發菌株CGMCC No.5234接種至平板培養基厭氧培養，培養溫度37℃，培養時間12h。將平板培養的重組菌接種到種子培養基(不加瓊脂，其他組分同P2平板培養基)中37℃靜止培養12h。

固定化發酵：吸附固定化細胞發酵放大工藝在自制的不銹鋼反應器中進行。反應器柱狀，有效容積約2L，內徑10cm，高30cm，外壁有夾套，可通過硅膠管與外置恒溫水浴鍋相連，進而實現發酵保溫。反應器上下兩端和側面在適當位置裝有用于取樣、液體循環、探頭檢測的管道和閥門。材料填裝時，固定化材料CTF與不銹鋼絲網(孔徑約2mm，厚度不足1mm)交替纏繞，松緊適度，如圖4所示，然后置于2L不銹鋼反應器中。發酵液靜止反應12h，維持發酵溫度37℃，通過蠕動泵對反應器中的發酵液進行循環，循環流速約20-35mL/min，每12h換一次液，發酵培養120h。

由圖5可知，出發菌EPS宏觀形態為白色粘液狀團聚體，其中含有大量孔穴和通道；敲除菌肉眼基本觀察不到EPS。

實施例3：利用激光共聚焦顯微鏡觀察敲除菌與出發菌生物膜的結構與厚度。

利用載玻片生物膜培養法培養丙丁菌生物膜，用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的刀豆蛋白A(FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)雙重免疫熒光技術染色，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜結構和其中胞外多糖的分布,并對生物膜進行逐層水平掃描,根據三維坐標系Z軸距離計算生物膜厚度。

具體操作如下：

(1)生物膜標本的制備

在100mL肖特瓶內放入25mm×75mm載玻片，裝入50mL發酵液厭氧靜置培養。在培養6、24和72h后取出載玻片，用0.1M，pH＝7.4PBS緩沖液反復沖洗,除掉表面浮游菌,無菌濾紙吸干多余液體,用2.5％戊二醛4℃固定玻片1.5h后，懸浮于0.1M，pH＝7.4的PBS緩沖溶液中，待用。

(2)生物膜標本的染色

多糖染色：FITC-ConA與生物膜中的多糖結合發出綠色熒光。將FITC-ConA配成1mg/mL溶液，呈黃色，樣品4℃避光染色15-30min后，用PBS緩沖液清洗去除殘留染色劑。FITC-ConA激發/發射波長：488/505nm。

細胞染色：PI與菌體內的DNA結合發出紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。樣品4℃避光染色15-30min后，用PBS緩沖液清洗去除殘留染色劑。PI激發/發射波長為：536/617nm。

(3)CLSM觀察生物膜及厚度測量

生物膜觀察:采用LSM 510型激光共聚焦掃描顯微鏡,37℃恒溫載物臺,物鏡倒置。掃描模式:HeNe/Ar激光,Ex/Em為490/525nm和536/617nm。

生物膜厚度確定:建立三維坐標體系，調節聚焦平面位置，對生物膜標本由外(生物膜游離面)向內(生物膜與玻片相貼面)逐層水平掃描,掃描30層，并進行3D圖像重建，則第一張與最后一張能觀察到生物膜的掃描圖片間的Z軸距離為生物膜厚度。

由圖6可知，在初始黏附期，出發菌株生物膜中多糖含量較多，而細菌含量相比較少，多糖形成多處較大的積聚區域，但相互之間的聯系并不緊密，細菌形成較小團塊，形如細菌鑲嵌于多糖基質中；而敲除菌中細菌大部分成散落分布，大部分區域細菌和多糖關系并不密切。在對數生長期，出發菌株生物膜中細菌大量繁殖，細菌和多糖的關聯開始緊密，已開始形成多糖和細菌相互包裹的網絡狀結構；而敲除菌中菌落間的細菌分布厚薄不均，形成溝壑間隙。在成熟穩定期，出發菌株多糖染色明顯多于細菌染色，細菌鑲嵌在由大量多糖形成的基質中，結構緊密，形成菌囊樣的結構，生物膜厚度為24.6μm；而敲除菌中細菌和多糖的關聯依舊并不緊密，生物膜厚度為5.81μm。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工業大學

<120> 一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法

<130> SG20181008001

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 846

<212> DNA

<213> CA_C2071基因核苷酸序列

<400> 1

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cttaatgatt acttgcttaa ccaaagcgat atgatagttg ttggaatagc aaaggatgga 120

gtggaagctt taaagcttat agagaataaa aagcctgacc ttgttgttct cgatataata 180

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atggagcttt tatcagcagt tactaaggaa ttatatcctt ctattgcaaa aaaatacaat 660

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<213> 內含子核苷酸序列

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 4

cagcaatcat agcaataaat 20

<210> 5

<211> 8925

<212> DNA

<213> PMTL007C-E2質粒核苷酸序列

<400> 5

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atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac aaaaaaaaat acttgttatg 5040

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tggtgaagta catcaccgac gagcaaggca agaccgatcg ggccc 8925