本發明涉及一種栽培菌種的制備方法，具體是一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌枝條菌種的制備方法。
背景技術：
食用菌生產無公害、純天然，可循環、可再生、環保。食用菌已成為傳統農業生產領域中繼糧、棉、油、果、菜后的第六大宗農產品；在農業現代化進程中食用菌產業已經成為現代農業發展的排頭兵和主力軍；國務院發展研究中心的侯正祥稱，作為朝陽產業食用菌即將超過中國的糧棉油產業，超過中國的汽車產業。
進入新世紀，我國食用菌生產技術發展日新月異，在許多技術領域不斷突破，正由食用菌大國向食用菌強國邁進。然而食用菌栽培菌種制備技術工藝卻始終困擾食用菌生產。
原因在于目前生產中普遍使用的“固體菌種”(包括枝條菌種)存在制種周期長，隱性污染幾率大，菌齡不齊和難以標準化管理等弊端，導致生產者成本升高，生產風險加大。近年來普遍推廣使用的“液體菌種”技術制種周期縮短，菌齡整齊，生產效率高，比傳統固體菌種具有明顯優勢。
然而，由于液體菌種對生產設備設施條件要求高，對生產人員的操作專業水平要求高，對運輸和儲藏的技術條件要求高，比較適合規模化、機械化的工廠化生產應用，而對于目前國內仍占多數的傳統勞動集約化生產模式來說，使用液體菌種存在較大風險。自上世紀90年代起，我國不少科研院所、企業在整體技術、設備投入不完善、不成熟的條件下，急于推廣應用食用菌液體菌種，造成大面積污染、絕大多數設備閑置、浪費，導致國內食用菌生產對液體菌種的應用態度曖昧，褒貶不一，生產者不得不又回歸“固體菌種”時代。因此我國食用菌液體菌種制備技術亟待創新與升級。
因此，開發一種將液體菌種技術與固體菌種工藝相結合的食用菌菌種制備方法，集成食用菌液體菌種活力強、生長快和固體菌種易保存、使用方便的綜合優勢，不僅是生產需要的，也是可行的。
一次性竹筷在我國使用數量巨大，大多成為廢棄物造成污染和浪費。而竹筷的主要成分是纖維素，對于食用菌生長來說是適宜的營養基質，可以用來作為培養食用菌的載體，尤其是制備食用菌枝條菌種的良好材料。枝條菌種是食用菌生產中經常使用的一類固體菌種形式。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌種的制備方法，該方法提高了菌種質量和生產效率。
為了達到上述技術目的，本發明的技術方案是：
一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌種的制備方法，包括以下步驟：
(1)竹筷經過清洗，使竹筷吸透水，然后將竹筷打毛，使竹筷表面變粗糙；
(2)將食用菌菌株接種到PDA斜面培養基中進行活化培養；
(3)配置液體培養基，液體培養基包括葡萄糖2.00g～2.50g/100mL，酵母浸出物0.20g～0.30g/100mL，磷酸二氫鉀0.20g～0.25g/100mL，硫酸鎂0.10g～0.15g/100mL,121℃滅菌20min。液體培養基優選包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氫鉀0.25g/100mL，硫酸鎂0.15g/100mL。
(4)將PDA斜面培養基中活化好的食用菌菌絲體接種于液體培養基中。
(5)在發酵溫度為24～26℃，優選25℃，搖床轉速為160～180r/min(搖床轉速優選180r/min)條件下發酵，發酵時間為6d。
(6)將發酵好的液體菌絲球打碎，用無菌水稀釋倍數300-500倍獲得液體菌種。
(7)配制種包栽培輔料，所述種包栽培輔料包括以下質量百分比組分：木屑40％、棉籽殼50％、麩皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述種包栽培輔料加水至60％的含水量。
(8)種包栽培輔料內排滿處理好的竹筷，數量為120-140支竹筷/包，竹筷的間隙和表面用輔料覆蓋。
(9)將種包放入蒸汽滅菌鍋內滅菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽壓力下對竹筷滅菌40-50分鐘；滅菌完成后，袋袋溫降到33℃以下，接種培養好的食用菌液體菌絲，接種量為20-25mL/包。
在食用菌技術研究及生產應用中，一般的固體基質(竹筷等)的滅菌條件為0.138MPa，126℃，滅菌120分鐘左右，這種滅菌條件耗時耗能，而且造成竹筷基質營養成分的流失。本發明的滅菌參數不僅能夠起到很好的滅菌效果，而且減少了竹筷基質營養成分的流失和能源的浪費，其技術原理是：利用液體菌接種竹筷枝條萌發快、生長迅速的特點(液體菌絲可以迅速布滿竹筷表面并向內部生長，使食用菌菌絲生長處于優勢狀態，從而抑制雜菌生長)，在適當降低滅菌參數的同時，不會影響竹筷表面食用菌菌絲正常生長；另一方面，由于本發明的滅菌參數降低了處理溫度，縮短了處理時間，從而減少了竹筷基質營養成分的流失和能源的浪費。
液體菌轉接竹筷枝條包時，接種量的大小直接影響接種后菌絲萌發生長效果。如果接種量小，不僅菌絲生長緩慢，而且較長的生長周期容易造成枝條被雜菌污染。若接種量大，不僅造成資源浪費，而且對衛生環境和制冷、通風設備要求高，無法適應技術力量薄弱，菌種技術人員不足的工廠，特別是無法很好地適用于分散式種植農戶。更重要的是，接種量大，會在枝條表面形成一層菌粘膜，菌粘膜將阻礙外部新鮮空氣進入，這將導致內部菌絲因缺氧而無法正常生長，最終造成雜菌侵染，增加液體菌種的使用風險。20-25mL/140枝/包的接種量克服了上述的矛盾，在確保萌發效果的基礎上，減少資源的浪費，避免在枝條表面形成一層菌粘膜，不會阻礙新鮮空氣的進入，確保了氧氣的正常供應，保證了菌絲的正常生長。
(10)將接種好的種包袋置于26℃條件下培養,當菌絲長滿袋后，繼續培養3-5天，使包內竹筷長滿菌絲。
本發明將食用菌液體菌種代替固體培養物接種竹筷，結合食用菌枝條菌種培養技術，形成“液體菌種+竹筷”的食用菌菌種制備工藝，一方面改進了原來液體菌種技術操作難，易污染的不足，同時提高了傳統枝條菌種質量和生產效率，使枝條菌種生產周期縮短至原來的2/3，生產性狀無明顯下降，且具有萌發快的優勢。
具體實施方式
試驗菌種：杏鮑菇。
PDA固體培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL，pH自然。
(1)將一次性竹筷(如廢舊一次性竹筷)截成長7.5cm、直徑0.5公分長條，竹筷經過清洗，使竹筷吸透水，然后將竹筷打毛，使竹筷表面變粗糙。
(2)將食用菌菌株接種到PDA斜面培養基中進行活化培養。
(3)配置液體培養基，液體培養基包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氫鉀0.25g/100mL，硫酸鎂0.15g/100mL，121℃滅菌20min。
(4)將PDA斜面培養基中活化好的食用菌菌絲體接種于液體培養基中。
(5)在發酵溫度為25℃，搖床轉速為180r/min條件下發酵，發酵時間為6d。
在上述液體培養基及發酵條件下，發酵菌絲體生物量(干重)可達到1.93g/100mL，產量提高了1.24倍。
(6)將發酵好的液體菌絲球打碎，用無菌水稀釋倍數500倍獲得液體菌種。
純菌種在不同稀釋度條件下，當接種量為10mL/袋時，菌絲的生長速度相對較慢，當接種量為20mL/袋和30mL/袋時的菌絲生長速度基本一致，都在同一天長滿栽培袋的，而且其菌絲生長速度都大于接種量為10mL/袋時的生長速度。稀釋500倍的菌種的菌絲生長速度相對也是最快。所以綜合來看，純菌種的最佳稀釋倍數為500倍。
(7)配制種包栽培輔料，所述種包栽培輔料包括以下質量百分比組分：木屑40％、棉籽殼50％、麩皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述種包栽培輔料加水至60％的含水量。
(8)種包栽培輔料內排滿處理好的竹筷，數量為140支竹筷/包，竹筷的間隙和表面用種包栽培輔料覆蓋。
(9)將種包放入蒸汽滅菌鍋內滅菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽壓力下對竹筷滅菌50分鐘；滅菌完成后，待袋溫降到33℃以下，接種培養好的食用菌液體菌絲，接種量為25mL/包。
當接種量為20mL/包時，菌絲的生長與接種量為25mL/包時無明顯的區別，基本相當。
(10)將接種好的種包袋置于26℃條件下培養,當菌絲長滿袋后，繼續培養3-5天，使包內竹筷長滿菌絲。
當菌絲長滿袋后，繼續培養3-5天進行擴大栽培；，使包內竹筷內部長滿菌絲。
由于液體菌種生長迅速，接種竹筷后，竹筷制種包發菌速度明顯加快。采用傳統制備工藝生產枝條種周期為30-40天，利用“液體菌種+竹筷”技術，菌種生產周期為20-25天。
上述實施例不以任何方式限制本發明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術方案均落在本發明的保護范圍內。