本發明涉及一種生物制劑培養基添加劑，具體地說是一種生物制劑培養基添加劑及生產方法和在培養基中的應用，特別是涉及一種采用膽鹽為原料制備的生物制劑培養基添加劑及生產方法和在培養基中的應用。
背景技術：
生物制劑是以各類具有醫研價值的碳基生物為原料，利用傳統技術或現代生物技術制造，作用于人體各類生理癥狀的預防（保健）、治療和診斷的各種形態制劑。培養基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配制的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。
三號膽鹽（Bile Salts №3，簡稱BSNT）在細菌檢驗工作中常用作選擇性抑菌劑和鑒定劑，是微生物培養、食品衛生檢測、衛生防疫和醫藥工業等方面常用的一種生化制劑。經檢測它是由CA(膽酸)和DCA（去氧膽酸）與Na+結合形成的膽鹽產品，其中CA和DCA的含量分別為63.95﹪和20.01﹪。其制備工藝包括水解、酸沉、脫脂、堿溶脫色步驟（化學試劑，1997，19⑴，P15～18、P44三號膽鹽的研制，張延坤等）。三號膽鹽最早由英國Oxoid和美國Difco兩公司生產。上世紀八十年代進入我國市場，每公斤的售價當時為1500美元左右。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種采用膽鹽為原料制備的生物制劑培養基添加劑及生產方法和在培養基中的應用。
膽鹽為牛膽鹽，按專利號ZL201410413922.5所述方法生產，其膽鹽中膽酸含量55﹪～70﹪。本發明為添加劑主要成份。
十二烷基硫酸鈉為白色或淡黃色粉狀，是一種無毒的陰離子表面活性劑，易溶于水，與陰離子、非離子復配伍性好，具有良好的乳化、發泡、滲透、去污和分散性能。本發明在添加劑中主要用于降低膽鹽水溶液的表面張力，提高膽鹽水溶液的清亮度。
去氧膽酸鈉為白色結晶性粉末，類似膽汁氣味，有強烈苦味，易吸濕，易溶于水，微溶于無水醇，不溶于醚。用于配制細菌培養基，代替腦磷脂作膽固醇絮狀試驗，蛋白質分析。本發明在添加劑中協助膽鹽抑制大腸桿菌。
偏硅酸鈉為普通泡化堿與燒堿水熱反應而制得的低分子晶體，商品有無水物、五水物和九水物，用作防腐劑、洗滌劑、粘合劑、防火劑和防水劑等。本發明偏硅酸鈉為無水物，在添加劑中協助膽鹽抑制大腸桿菌。
強氯凈主要成分是三氯異氰尿酸，為有機化合物，白色結晶性粉末或粒狀固體，具有強烈的氯氣刺激味。三氯異氰尿酸是一種極強的氧化劑和氯化劑，具有高效、廣譜、較為安全的消毒作用，對細菌、病毒、真菌、芽孢等都有殺滅作用，對球蟲卵囊也有一定殺滅作用。本發明在添加劑中協助膽鹽抑制大腸桿菌。
本發明是采用如下技術方案實現其發明目的的，一種生物制劑培養基添加劑，以重量計，它由膽鹽、10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉、2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉、4﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉、0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強氯凈混配而成；所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪。
本發明所述膽鹽中膽酸含量優選為60﹪～65﹪。
本發明所述十二烷基硫酸鈉優選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強氯凈優選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。
一種如上所述生物制劑培養基添加劑在培養基中的應用，即用于微生物SS瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基的配制。
一種如權利要求1所述生物制劑培養基添加劑的生產方法，它包括下列步驟：
⑴以重量計，選取膽鹽，10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉，2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉，5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉，0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強氯凈，所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪；
⑵先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨30分鐘～90分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨90分鐘～150分鐘，即制備得目數為120目～150目的生物制劑培養基添加劑。
本發明在步驟⑴中，所述膽鹽中膽酸含量優選為60﹪～65﹪。
本發明在步驟⑴中，所述十二烷基硫酸鈉優選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強氯凈優選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。
由于采用上述技術方案，本發明較好的實現了發明目的，其配方合理，生產方法簡單，經試驗，制備的生物制劑培養基添加劑可有效替代進口三號膽鹽用于配制微生物培養基SS瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例1：
一種生物制劑培養基添加劑，以重量計，它由膽鹽、10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉、2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉、5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉、0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強氯凈混配而成；所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪。
本發明所述膽鹽中膽酸含量優選為60﹪～65﹪。
本發明所述十二烷基硫酸鈉優選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強氯凈優選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。
一種如上所述生物制劑培養基添加劑的生產方法，它包括下列步驟：
⑴以重量計，選取膽鹽，10﹪～15﹪膽鹽重的十二烷基硫酸鈉，2﹪～5.0﹪膽鹽重的去氧膽酸鈉，5﹪～7﹪膽鹽重的偏硅酸鈉，0.2﹪～0.8﹪膽鹽重的強氯凈，所述膽鹽中膽酸含量為50﹪～70﹪；
⑵先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨30分鐘～90分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨90分鐘～150分鐘，即制備得目數為120目～150目的生物制劑培養基添加劑。
本發明在步驟⑴中，所述膽鹽中膽酸含量優選為60﹪～65﹪。
本發明在步驟⑴中，所述十二烷基硫酸鈉優選為膽鹽重的10﹪～12﹪，所述去氧膽酸鈉優選為膽鹽重的2﹪～2.5﹪，所述偏硅酸鈉優選為膽鹽重的5﹪～6﹪，所述強氯凈優選為膽鹽重的0.5﹪～0.8﹪。
一種如上所述生物制劑培養基添加劑在培養基中的應用，即用于微生物SS瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基的配制。
本實施例制備的所述生物制劑培養基添加劑用于配制SS瓊脂培養基。
本實施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量60.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉520g（13﹪），去氧膽酸鈉165g（4.125﹪），偏硅酸鈉(無水)170g（4.25﹪），強氯凈25g（0.625﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨120分鐘，即制備得目數為140目的生物制劑培養基添加劑。
在配制SS瓊脂培養基（2010年版國標）時，取乳糖10克、檸檬酸鈉10克，牛肉膏粉5克、蛋白胨5克、無水硫代硫酸鈉8.5克、檸檬酸鐵1克、瓊脂粉12克、生物制劑培養基添加劑8.5克、煌綠0.00033克、中性紅0.025克。溶于1000ml蒸餾水中,煮沸至全部溶解，冷卻至55℃左右倒平皿約三毫米厚，置37℃恒溫箱中，2～3小時后取出平皿接種各種細菌。24小時后，觀察結果得知金黃色葡萄球菌（ATCC6538）受到抑制；大腸埃希氏菌（ATCC25922）部分受到抑制，菌落少，菌落直徑最大不超過2㎜；鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）菌落中心大部分有黑心，菌落直徑≥1.8㎜；福氏志賀氏菌（CMCC51572）菌落透明，菌落直徑2㎜左右。由實驗可知，加入生物制劑培養基添加劑的SS瓊脂培養基可用于檢測待檢物，如體檢時檢測糞便，各種食品、肉、禽等，對致病菌的檢出率在70﹪以上。
本生物制劑培養基添加劑中的膽鹽是十分重要的成分，對大腸桿菌起抑制作用，對致病菌起促進生長的作用。此外，在配制SS瓊脂培養基時，膽鹽、十二烷基硫酸鈉、強氯凈、偏硅酸鈉和去氧膽酸鈉能協同抑制大腸桿菌的生長，比單獨使用一種試劑要好，特別是強氯凈含氯，對大腸桿菌特別敏感，同時，偏硅酸鈉和去氧膽酸還有促進致病菌生長的作用。本發明的生物制劑培養基添加劑可有效替代進口三號膽鹽用于SS瓊脂培養基的配制。
實施例2：
本實施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量65.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉550g（13.75﹪），去氧膽酸鈉180g（4.5﹪），偏硅酸鈉(無水)180g（4.5﹪），強氯凈20g（0.5﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨120分鐘，即制備得目數為140目的生物制劑培養基添加劑。
余同實施例1。
實施例3：
本實施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量52.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉480g（12﹪），去氧膽酸鈉100g（2.5﹪），偏硅酸鈉(無水)188g（4.7﹪），強氯凈16g（0.4﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨120分鐘，即制備得目數為140目的生物制劑培養基添加劑。
在配制麥康凱瓊脂培養基（2010年版國標）時，取蛋白胨7g、酵母浸出粉3g 、乳糖10g、氯化鈉5g、三號膽鹽1.5g、中性紅0.03g、結晶紫0.002g，溶于1000ml蒸餾水，煮沸全部溶解后，調pH7.4±0.2，冷至55℃左右，倒平板，平板置37℃恒溫箱。2～3小時后取出平皿接種細菌。24小時后，觀察結果得知金黃色葡萄球菌（ATCC6538）受到完全抑制；大腸埃希氏菌（ATCC25922）部分受到抑制，菌落少，菌落直徑最大不超過2㎜，菌落周圍有沉淀環；福氏志賀氏菌（CMCC51572）菌落透明，菌落直徑≥2.0㎜；痢疾志賀氏菌（CMCC51105）菌落透明，菌落直徑≥2.0㎜。由實驗可知，加入生物制劑培養基添加劑的麥康凱瓊脂培養基可用于檢測待檢物，如體檢時檢測糞便，各種食品、肉、禽等，對致病菌的檢出率在75﹪以上。
聯合國世界衛生組織（WHO）早在上世紀八十年代便極力推薦使用麥康凱瓊脂，國家衛生部部頒標準也于2010年載入。本發明的生物制劑培養基添加劑可有效替代進口三號膽鹽用于麥康凱瓊脂培養基的配制。
實施例4：
本實施例取膽鹽（按專利號ZL201410413922.5所述方法生產的牛膽鹽，其膽鹽中膽酸含量55.0﹪）4000g，十二烷基硫酸鈉560g（14﹪），去氧膽酸鈉160g（4.0﹪），偏硅酸鈉(無水)170g（4.25﹪），強氯凈18g（0.45﹪）；先將膽鹽、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、偏硅酸鈉球磨60分鐘，再加入強氯凈，繼續球磨120分鐘，即制備得目數為140目的生物制劑培養基添加劑。
余同實施例3。