PCR檢測多房棘球蚴的方法及檢測試劑盒與流程

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其是涉及一種PCR技術檢測多房棘球蚴的方法。

背景技術：

棘球蚴病(Echinococcosis)俗稱包蟲病(hydatid disease),是由棘球絳蟲的幼蟲棘球蚴寄生于動物(包括人)的肝、肺等組織器官引起的一種人畜共患寄生蟲病。該病流行于全球廣大牧業區，是全球性公共衛生的重要問題之一。在中國，棘球蚴病廣泛流行于北方和西南地區，是一種危害極其嚴重的人畜共患寄生蟲病。棘球屬絳蟲被公認至少有9個種，分別是細粒棘球絳蟲(E.granulosus)、多房棘球絳蟲(E.mulitilocularis)、伏氏棘球絳蟲(E.vogeli)、少節棘球絳蟲(E.oligarthra)、石渠棘球絳蟲(E.shiquicus)、加拿大棘球絳蟲(E.canadensis)、奧氏棘球絳蟲(E.ortleppi)和貓棘球絳蟲(又名獅棘球絳蟲，E.felidis)。其中多房棘球蚴感染人后為泡型棘球，又稱泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)或泡型包蟲病，其每年新發病例約為18235例，其中91％的患者在中國。多房棘球蚴在早期寄生于中間宿主肝內，致局部肝組織病變、增生、肝纖維化、萎縮、變性和壞死，而臨床癥狀不明顯；晚期似肝癌樣轉移，能轉移至肺、腦、乳腺等臟器，即使進行肝部分或半葉切除治療，術后復發率也很高，故臨床有“蟲癌”之稱。據統計未經治療的AE患者10年病死率高達94％。早期感染泡型包蟲病患者并沒有任何癥狀，牧區患者往往在晚期才會發現，所以只能進行手術治療。目前主要使用B超、CT、X射線和磁共振(MRI)等影像學檢查以及酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白質印跡(Western blotting)等免疫學試驗進行診斷。影像學檢查時，一些非典型和體積較小的病灶常與肝癌和肝膿腫等相混淆，而血清學診斷使用的粗抗原則因缺乏敏感性和特異性，與細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus，Eg)、豬囊尾蚴及其他寄生蟲的抗原存在交叉反應。因此研制開發高度敏感、特異的早期診斷泡型包蟲病的方法及試劑盒是早期控制和治療泡型包蟲病的一種切實有效的方法，并且在使用方面具有廣闊的應用前景。

線粒體DNA是裸露的DNA雙鏈分子，主要呈環狀，可參與蛋白質的合成、轉錄與復制。線粒體DNA所有基因都位于一個單一的環狀DNA分子上，遺傳物質不為核膜所包被，且不被蛋白質壓縮。線粒體DNA主要的特點是不包含很多的非編碼區域，并且穩定性比DNA要高很多，所以設計針對多房棘球蚴線粒體DNA的引物，使檢測多房棘球蚴的結果更穩定。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種PCR檢測多房棘球蚴的方法，通過設計針對棘球蚴線粒體DNA的引物，采用PCR檢測技術檢測出多房棘球蚴DNA。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種用于檢測多房棘球蚴的PCR引物對，所述PCR引物對包括外引物對和/或內引物對，

所述外引物對的序列如下：

上游引物AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

所述內引物對的序列如下：

上游引物AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)。

一種PCR檢測多房棘球蚴的試劑盒，該試劑盒含有如權利要求1所述的PCR引物對。

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的一種或多種。

優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

一種PCR檢測多房棘球蚴的方法，該方法利用上述的PCR引物對，或上述的試劑盒對多房棘球蚴進行PCR檢測。

優選地，該方法包括以下步驟：

1)提取樣品組織中的總DNA；

2)以步驟1)中的總DNA為模板，AE-M1F和AE-M1R為引物，或以AE-M2F和AE-M2R為引物，進行PCR擴增反應；

3)分析PCR產物。

優選地，對于以AE-M1F和AE-M1R為PCR引物對的PCR反應體系以20μL計為：

2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物AE-M1F，0.45μL；10μM引物AE-M1R，0.45μL；DNA模板，2μL；ddH₂O，7.1μL；總反應體系為20μL。

優選地，對于以AE-M1F和AE-M1R為PCR引物對的PCR反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性30s，52℃退火15s，72℃延伸30s，共30個循環；最后72℃延伸10min，1個循環；擴增產物大小為250-260bp。

優選地，對于以AE-M2F和AE-M2R為PCR引物對的PCR反應體系以20μL計為：

2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物AE-M2F，0.45μL；10μM引物AE-M2R，0.45μL；DNA模板，2μL；ddH₂O，7.1μL；總反應體系為20μL。

優選地，對于以AE-M2F和AE-M2R為PCR引物對的PCR反應條件為：94℃預變性3min；95℃變性30s，63℃退火10s，72℃延伸30s，共10個循環；95℃變性30s，61℃退火10s，72℃延伸30s，共20個循環；最后72℃延伸5min，1個循環；擴增產物大小為130-140bp。

本發明的有益效果如下：

(1)準確度高，本發明根據多房棘球蚴線粒體DNA序列設計引物，并經過對PCR產物進行測序比對，可以準確的檢測出多房棘球蚴DNA。

(2)敏感度高，本發明從樣品中提取DNA作為模板，并用引物AE-M1F、AE-M1R及AE-M2F、AE-M2R進行PCR高效擴增，可以對樣本中微量蟲源線粒體DNA進行擴增并達到檢出的水平。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為不含有和含有多房棘球蚴樣品DNA；

圖2為引物AE-M1F和AE-M1R的PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖3為引物AE-M1F和AE-M1R的擴增產物膠回收后測序結果；

圖4為測序結果在NCBI上Blast比對結果；

圖5為引物AE-M2F和AE-M2R的PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖6為多房棘球蚴檢測試劑盒的巢式PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明的思路如下：基于多房棘球蚴線粒體DNA的穩定性，設計針對多房棘球蚴線粒體DNA的引物，篩選出可以區分多房棘球蚴DNA的特異性引物，再使用PCR技術進行擴增，對擴增產物進行測序比對，得知該擴增產物是否為多房棘球蚴DNA的擴增產物；使其能夠達到準確判斷多房棘球蚴DNA的水平。經優化后的引物與擴增條件進行PCR實驗證明可以完全識別多房棘球蚴DNA。

材料

1.樣本：含有多房棘球蚴的樣品及不含有多房棘球蚴的樣品；

2.DNA提取：使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(50次)試劑盒提取；

3.DNA電泳緩沖液(50x TAE)：稱取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H₂O和57.1mL冰乙酸，加水至1000mL，使用時稀釋50倍；

4.2×Taq PCR MasterMix；

5.PCR儀：Eppendorf AG。

實例1：

DNA的提取

1.5mL離心管中加20μL Protease K，加200μL的樣品液，加200μL的Buffer AL，渦旋15s；

56℃溫育10min，直到裂解完全，快速離心；

加200μL乙醇(100％)，渦旋15s，快速離心；

轉移混合液到Spin column(2mL收集管)，6000g或8000rpm，離1min，換新管，棄掉舊的收集管；

加500μL Buffer AW1，渦旋15s，6000g或8000rpm，離1min，棄舊管換新管；

加500μL Buffer AW2，渦旋15s，全速(20，000g或14，000rpm)離1min換新管，全速(20，000g或14，000rpm)空管離心3min；

新離心管，100μL Buffer AE溫室溫育5min，6000g或8000rpm，離1min，重復洗脫3次；

圖1為含有多房棘球蚴的樣品及不含有多房棘球蚴的樣品的凝膠電泳圖；

圖1中，泳道1：DNA Marker D15000；

泳道2：DNA Marker D2000；

泳道3-7：含有多房棘球蚴的樣品；

泳道8-12：不含有多房棘球蚴的樣品。

實例2：

設計AE-M1F和AE-M1R引物擴增DNA

設計引物AE-M1F和AE-M1R；

AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M1F和AE-M1R從DNA擴增基因的反應體系如下：

PCR反應條件為：

95℃預變性30sec，95℃變性30sec，52℃退火15sec，72℃延伸30sec，共30個循環；

最后72℃延伸10min；

擴增產物大小為256bp。

結果：AE-M1F和AE-M1R可以從含有多房棘球蚴的樣品中擴增出序列，但是不含有多房棘球蚴的樣品DNA中未擴增出來序列，結果如圖2所示。

圖2中泳道1：DNA Marker；

泳道2：多房棘球蚴原頭節；

泳道3-12：含有多房棘球蚴樣品；

泳道13-17：不含有多房棘球蚴的樣品；

泳道18：陰性對照。

實例3：

擴增序列回收與比對分析

利用DNA片段凝膠回收純化試劑盒(北京天根生物技術有限公司)回收純化PCR擴增的基因，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果在數據庫進行比對。

圖3為引物AE-M1F和AE-M1R的擴增產物膠回收后的測序結果。

圖4為測序結果在NCBI上Blast比對結果，比對結果顯示該擴增片段來自多房棘球蚴線粒體DNA。

實例4

設計AE-M2F和AE-M2R引物擴增DNA

設計引物AE-M2F和AE-M2R；

AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M2F和AE-M2R從樣品中擴增基因的反應體系如下：

PCR反應條件為：

94℃預變性3min；95℃變性30sec，63℃退火10sec，72℃延伸30sec，共10個循環；95℃變性30sec，61℃退火10sec，72℃延伸30sec，共20個循環；

最后72℃延伸5min；

擴增產物大小為136bp。

結果：AE-M2F和AE-M2R可以從含有多房棘球蚴的樣品中擴增出序列，但是不含有多房棘球蚴的樣品DNA中未擴增出來序列，可以很好的區分含有多房棘球蚴的樣品和不含有多房棘球蚴的樣品，檢出率為100％，如圖5所示。

圖5為引物AE-M2F和AE-M2R的PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖5中泳道1：DNA Marker；

泳道2-5：不含多房棘球蚴樣本；

泳道6、7：試劑盒陽性質控；

泳道8：空；

泳道9-13：含有多房棘球蚴樣本；

泳道14：陰性；泳道15：DNA Marker。

實施例5

多房棘球蚴巢式PCR檢測試劑盒的評價

外引物：AE-M1F和AE-M1R；

AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

內引物：AE-M2F和AE-M2R；

AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M1F和AE-M1R從DNA擴增基因的反應體系如下：

PCR反應條件為：

95℃預變性30sec，95℃變性30sec，52℃退火15sec，72℃延伸30sec，共30個循環；

最后72℃延伸10min；收集外引物擴增產物。

以外引物擴增產物為模板，用內引物擴增反應體系如下：

多房棘球蚴檢測試劑盒可以從含有多房棘球蚴的樣品和陽性質控樣本中擴增出序列，但是不含有多房棘球蚴的樣品DNA中未擴增出來序列，可以很好的區分含有多房棘球蚴的樣品和不含有多房棘球蚴的樣品，檢出率為100％，如圖6所示。

圖6為多房棘球蚴檢測試劑盒的巢式PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖6中泳道1：DNA Marker；

泳道2-4：不含有多房棘球蚴的樣品；

泳道5-6：試劑盒陽性質控

泳道7-12：含有多房棘球蚴的樣品；

泳道13：陰性；

泳道14：DNA Marker。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海大學 青海知光精準醫學科技有限公司

<120> PCR檢測多房棘球蚴的方法及檢測試劑盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catctgcggt tagtctgt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtggaccat cctttact 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacagggatt agatacccca tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggaccatt ccctactatg c 21