表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHMW及構(gòu)建方法與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的重組病毒載體疫苗，具體涉及一種能夠表達(dá)具H7N9亞型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒rHMW，該重組病毒可用于免疫家禽預(yù)防H7N9亞型禽流感病毒中的用途。

背景技術(shù)：

感染人的H7N9亞型禽流感于2013年首次在我國(guó)華東的長(zhǎng)三角地區(qū)爆發(fā)，是一株三源重組的新型禽流感病毒，對(duì)家禽不致病或低致病性。截止目前已經(jīng)擴(kuò)散至全國(guó)除西藏和內(nèi)蒙古自治區(qū)外的所有地區(qū)，珠江三角區(qū)是繼長(zhǎng)三角地區(qū)后的又一新的爆發(fā)疫源地。根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)顯示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根據(jù)flutracters的追蹤報(bào)道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已經(jīng)突破800。其增長(zhǎng)速度直逼自從2003年以來(lái)人感染H5亞型禽流感數(shù)量已經(jīng)高達(dá)851例，由此可見(jiàn)人感染H7N9的數(shù)量增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，對(duì)公共衛(wèi)生的危害不容小覷。由于家禽感染不發(fā)病，感染的病例多有與活期接觸的流行病史，因此，活禽市場(chǎng)家禽的H7N9疫情狀態(tài)具有直接影響公共衛(wèi)生安全。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，人感染H7N9的高峰季節(jié)也與家禽的流行規(guī)律息息相關(guān)。因此亟需研制新型的疫苗來(lái)保護(hù)家禽，降低疫情對(duì)公共的危害。然而目前臨床尚無(wú)針對(duì)H7N9的家禽疫苗用于防控此類疾病。

火雞皰疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一種典型無(wú)致病性的α皰疹病毒。因HVT與馬立克病毒(Marek's disease virus，MDV)在遺傳學(xué)和血清學(xué)上具有相關(guān)性，自1970年以來(lái)，HVT Fc-126株作為MD疫苗被廣泛使用。該疫苗具有不會(huì)引發(fā)致瘤發(fā)生、保護(hù)效果良好、在體內(nèi)持續(xù)存在、可以凍干、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)戎T多優(yōu)點(diǎn)，在MD的防控過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。近年來(lái)，HVT作為病毒載體方面的研究取得了許多進(jìn)展，因HVT與其它禽病毒載體相比具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括：HVT對(duì)雞及其他動(dòng)物無(wú)致病性，安全性好；可以在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)存在、有利于外源基因的持續(xù)表達(dá)、刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平；HVT可引起高強(qiáng)度的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、免疫出現(xiàn)早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、接種一次可達(dá)到終生免疫；HVT重組疫苗具有生產(chǎn)成本低、可以凍干、易于貯存和運(yùn)輸；HVT具有很強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合特性、病毒于細(xì)胞間傳播、因此作為重組疫苗，可以突破母源抗體的干擾等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，傳染性法氏囊病毒等多種禽病保護(hù)性抗原均已在HVT載體中成功表達(dá)[Tsukamoto,K., et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious Bursal Disease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。應(yīng)用上述水平制備的VaxxitexRHVT+IBD重組疫苗已經(jīng)獲得生產(chǎn)許可，成為商品化的以皰疹病毒為載體的動(dòng)物源性疫苗，使HVT成為最具有開(kāi)發(fā)前景的病毒載體。其技術(shù)核心利用同源重組原理：通過(guò)外源基因兩側(cè)的非必需區(qū)同源臂與HVT基因組相對(duì)應(yīng)區(qū)段進(jìn)行同源交換，從而將外源基因?qū)牖蚪M中。1992年Morgan等人首次利用同源重組方法構(gòu)建了表達(dá)NDV(F)基因的重組HVT，該重組病毒既能抵抗致死性MDV的攻擊，又能預(yù)防新城疫，其保護(hù)率接近傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后來(lái)，Gao等人使用上述方法將AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因組不同的位置中，構(gòu)建了兩株rHVT重組病毒，疫苗試驗(yàn)表明這兩株重組病毒均可以同時(shí)抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1Virus at US2Gene Insertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10Gene Insertion Site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。

內(nèi)源性啟動(dòng)子具有克服針對(duì)抗原的母源抗體干擾作用。MDV基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，是受到嚴(yán)格調(diào)控的。如當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒基因的表達(dá)分為3個(gè)時(shí)期：立即早期、遲早期和晚期。但是，以MDV構(gòu)建重組病毒時(shí)，異源的強(qiáng)啟動(dòng)子受到病毒的調(diào)控較少，在重組病毒免疫的早期，該啟動(dòng)子所控制地保護(hù)抗原基因大量表達(dá)，與機(jī)體中針對(duì)該抗原的母源抗體發(fā)生反應(yīng)，使得針對(duì)該抗原的母源抗體下降，從而降低了機(jī)體對(duì)某種疾病的早期保護(hù)。Sonoda等(Sonoda,Kengo,et al."Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies."Journal of virology 74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB啟動(dòng)子構(gòu)建重組病毒，表達(dá)NDV的F基因，免疫商品雞，可以提供100％的保護(hù)，同時(shí)，并不影響重組病毒的穩(wěn)定性。因此，進(jìn)一步證實(shí)了MDV I型自身的gB啟動(dòng)子受到嚴(yán)格地調(diào)控，可以避免母源抗體的干擾，保證了免疫保護(hù)力。

影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，而密碼子的選擇是其中重要的參數(shù)之一，基因表達(dá)水平與嗜好密碼子的使用程度之間存在強(qiáng)的相關(guān)性。每個(gè)氨基酸平均有三個(gè)對(duì)應(yīng)密碼子，這使得不同的核苷酸序列可以編碼出相同的氨基酸序列，而編碼同一氨基酸的不同的密碼子在不同的生物和不同基因中的使用頻率有著顯著的差異，這與在細(xì)胞中相應(yīng)的tRNA的濃度是呈正相關(guān)的。使用頻率極低的就是該物種或基因的稀有密碼子，稀有密碼子的使用已經(jīng)被證實(shí) 為阻礙基因表達(dá)的一個(gè)重要因素，因此去除稀有密碼子能夠顯著提高一個(gè)基因的翻譯速度。每個(gè)物種都有對(duì)應(yīng)的偏嗜密碼子，因此為了提高外源基因在一個(gè)物種體內(nèi)的翻譯和表達(dá)水平，常常對(duì)外源基因密碼子進(jìn)行改造，使之符合該物種的密碼子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,et al."Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector."Antiviral research 75.3(2007):234-241.)等人對(duì)H5的HA密碼子優(yōu)化(optiHA)插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS上免疫SPF雞，優(yōu)化后的optiHA能夠顯著提高H5亞型禽流感DNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。

雞的組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)又稱為B復(fù)合體(Bcomplex)，主要由B-F，B-L和B-G三個(gè)各局功能的基因位點(diǎn)組成。其中B-F所編碼的抗原在結(jié)構(gòu)和功能上分別類似于哺乳動(dòng)物的MHCⅠ類抗原，并且存在于所有的細(xì)胞內(nèi)。MHCⅠ類分子與胞內(nèi)抗原蛋白結(jié)合，抗原表位被遞呈至細(xì)胞表面，同時(shí)也可刺激MHCⅡ分子的抗原遞呈反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別在外源抗原的N端添加MHCⅠss(MHCⅠsectionsignal)和C端添加MITD(MHCⅠtrafficking domain)能夠模仿MHC分子的抗原遞呈的過(guò)程，從而不但增強(qiáng)抗原遞呈效率，同時(shí)還能刺激CD8+和CD4+T細(xì)胞的多樣性反應(yīng)，這種嵌合型的抗原表達(dá)方式增強(qiáng)了抗原表達(dá)的效率和效果(Kreiter,Sebastian,et al."Increased antigen presentation efficiency by coupling antigens to MHC class I trafficking signals."The Journal of Immunology 180.1(2008):309-318.)。HVT是一種典型的嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合皰疹病毒，很難分離到游離的非細(xì)胞結(jié)合毒，主要通過(guò)細(xì)胞橋的方式感染臨近細(xì)胞。因此我們嘗試在去除HA自身的跨膜和胞內(nèi)區(qū)后，添加Gallus Gallus的MHCⅠss/MITD(Guillemot,Franpois,et al."A molecular map of the chicken major histocompatibility complex:the class II beta genes are closely linked to the class I genes and the nucleolar organizer."The EMBO journal 7.9(1988):2775.)以增強(qiáng)HA在HVT感染的細(xì)胞內(nèi)的抗原遞呈反應(yīng)效率，進(jìn)而促進(jìn)抗體上升速度和上升水平。

除了啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是影響基因表達(dá)的一個(gè)重要因素，增加適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件也可有效提高外源基因的表達(dá)水平。適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件也可有效提高外源基因的表達(dá)水平。在目的基因的3'端添加土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(Wood chuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)，可增加外源抗原基因表達(dá)水平(Zufferey,Romain,et al."Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors."Journal of virology 73.4(1999):2886-2892.)。

此外，多家跨國(guó)公司已經(jīng)研制出以HVT為載體的商品化疫苗。其中，法國(guó)梅里亞公司的 HVT用來(lái)表達(dá)傳染性法氏囊病(IBD)的VP2基因，即可用來(lái)預(yù)IBD，又能預(yù)防馬立克氏病(MD)，目前已經(jīng)在70多個(gè)國(guó)家銷售使用。詩(shī)華公司的 HVT系列產(chǎn)品中， ND表達(dá)新城疫病毒(NDV)的F基因，用于預(yù)防ND和MD； AI表達(dá)clade2.2(A/swan/Hungary/4999/2006)H5N1的HA蛋白，用于預(yù)防不同亞型的H5高致病性禽流感和MD，保護(hù)率在80％-100％。目前已經(jīng)在埃及，蒙古，越南等多個(gè)國(guó)家的家禽養(yǎng)殖業(yè)中投入使用，發(fā)揮了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于重組一種表達(dá)禽流感嵌合血凝素蛋白HA的重組HVT載體疫苗，為當(dāng)下流行和具有巨大公共衛(wèi)生安全意義的H7N9病毒提供一種從源頭上保護(hù)易感動(dòng)物的疫苗免疫保護(hù)策略。

一種表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白HA的重組火雞皰疹病毒株rHMW，是火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株，其保藏號(hào)CGMCC NO.12984。

一種構(gòu)建所述重組火雞皰疹病毒株rHMW的方法，包括過(guò)下述步驟：(1)密碼子優(yōu)化過(guò)后并刪除HA的跨膜和胞內(nèi)區(qū)與MHCIss和MITD嵌合成MOHA，帶有同源臂的pCMGFP(CN105002146A)質(zhì)粒經(jīng)EcoRV與Kpn2I雙酶切，MOHA經(jīng)EcoRV和NheI雙酶切，HgB經(jīng)NheI與Kpn2I雙酶切，將三個(gè)片段進(jìn)行三分子鏈接，轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMOHA；在質(zhì)粒pMOHA的多克隆位點(diǎn)MSC插入WPRE質(zhì)粒元件，連接完后的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Takala的JM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)37度培養(yǎng)過(guò)夜，挑斑提質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定，陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pHMW。(圖6)

(2)將中間轉(zhuǎn)移陽(yáng)性質(zhì)粒pHMW與rHVT-GFP的DNA進(jìn)行磷酸鈣共轉(zhuǎn)染-同源重組，重組得到的毒株命名為rHMW(圖7)。

本發(fā)明中，外源抗原為禽流感亞型為H7N9，血凝素HA來(lái)自H7N9亞型禽流感毒株JX148(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)，并刪除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的核苷酸；并在5'端添加Gallus的MHCⅠ(B complex)的信號(hào)肽(MHCⅠss)序列和在3'端添加MHCⅠ的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)MITD的核苷酸序列，嵌合后的核苷酸序列在SEQIDNO:2中顯示；在外源抗原后多克隆位點(diǎn)(MCS)插入WPRE基因。

本發(fā)明所述的rHMW構(gòu)建方法如下

根據(jù)已有的JX148HA的序列(GISAID:EPI_ISL_235293；genebank:KY005878)，以及Gallus gallus(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)的密碼子偏嗜頻率，交由公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成JX148-OHA(SEQ ID NO:1)。密碼子優(yōu)化過(guò)程中，避開(kāi)兩端的酶切位點(diǎn)和平衡全長(zhǎng)序列的GC含量。

HVT內(nèi)源性gB啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)分析與克隆。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)預(yù)測(cè)分析HVT的gB啟動(dòng)子，其特征為含有TATABox和CAATBox等真核啟動(dòng)子的閱讀框。并根據(jù)預(yù)測(cè)分析的結(jié)果設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的引物PCR擴(kuò)增HgB啟動(dòng)子。

嵌合抗原的構(gòu)建。將OHA根據(jù)SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)跨膜區(qū)分析后，刪除跨膜和胞內(nèi)區(qū)(TM)，命名為OHA-TM。將雞的MHCⅠss/MITD通過(guò)over-lapPCR的方式與刪除TM后的OHA-TM融合連接，形成融合抗原MOHA(SEQ ID NO:2)。

中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHMW的構(gòu)建。將合成的密碼子優(yōu)化過(guò)的MOHA和克隆的HgB使用相應(yīng)的酶切后膠回收，并在帶有同源臂的pCMGFP基礎(chǔ)上依次進(jìn)行連接替換HgB啟動(dòng)子和表達(dá)外源的MOHA基因，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMOHA(pHgB-MOHA)。并在該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(MSC)插入WPRE(SEQ ID NO:4)質(zhì)粒元件。連接完后的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Takala的JM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)37度培養(yǎng)過(guò)夜。挑斑提質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定，陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pHMW(pHgB-MOHA-WPRE)；(如圖6所示)。

將中間轉(zhuǎn)移陽(yáng)性質(zhì)粒與rHVT-GFP的DNA進(jìn)行磷酸鈣共轉(zhuǎn)染-同源重組。使用傳統(tǒng)的酚氯仿法提取rHVT-GFP感染后病變80％-90％CEF的全基因組DNA，與中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒磷酸鈣共轉(zhuǎn)染次代CEF細(xì)胞(Morgan，1990)，待4-7天后出現(xiàn)病變蝕斑后，在熒光顯微鏡下篩選不帶綠色熒光的蝕斑并標(biāo)記，用槍頭吸取少量胰酶后消化不帶熒光的蝕斑，接種到次代CEF的96孔板上。經(jīng)過(guò)3-5次的純化后純化出完全不帶熒光的蝕斑，進(jìn)行IFA鑒定，并提取DNA，PCR擴(kuò)增后測(cè)序鑒定。將重組得到的毒株命名為rHMW；(如圖7所示)。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述的重組火雞皰疹病毒株rHMW在制備預(yù)防H7N9亞型禽流感病毒的疫苗中的用途。

附圖說(shuō)明

圖1質(zhì)粒構(gòu)建策略

圖2中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHMW圖譜

圖3 pHMW雙酶切鑒定，(M為1000bp的marker，1為為酶切的質(zhì)粒，2為經(jīng)EcoRV和Kpn2I雙酶切的結(jié)果)。

圖4重組毒株的PCR鑒定，(M為1000bp的Marker，1為PCR結(jié)果)。

圖5 rHMW的IFA結(jié)果(B)和陰性對(duì)照(A)

圖6中間質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖

圖7轉(zhuǎn)染、重組以及篩選和鑒定示意圖

本發(fā)明毒株rHMW于2016年9月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株；保藏號(hào)CGMCC NO.12984。

具體實(shí)施方式

材料

rHVT-GFP和pCMGFP由由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存(參見(jiàn)專利申請(qǐng)公布號(hào)：CN105002146A)。H7N9亞型禽流感JX148(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)(GISAID：EPI_ISL_235293),由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存，雞胚效價(jià)為10，血凝抑制反應(yīng)證明JX148的多抗血清與其他亞型的H7N9具有較高的交叉反應(yīng)性。

High fidelity DNA polymerase、T4DNA連接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit購(gòu)自Roche公司；質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)為QIAGEN公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

步驟一、密碼子優(yōu)化與合成

根據(jù)JX148HA的序列(EPI_ISL_235293)，交由南京金斯瑞公司參照雞(Gallus gallus)的密碼子偏嗜(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)進(jìn)行密碼子優(yōu)化與合成optiHA(OHA)，添加酶切位點(diǎn)后克隆到UC57載體上，命名為UC57-OHA。

步驟二、擴(kuò)增HVT的內(nèi)源性gB啟動(dòng)子

使用DNeasy Blood tissue kit抽提FC126(GenBank:AF291866)的基因組DNA。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)在線預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子含有TAAT和CAAT等真核生物啟動(dòng)子的順式作用元件。并合成引物，使用引物gB-F/R克隆FC126的gB啟動(dòng)子(HgB，SEQ ID NO:3)，啟動(dòng)子在首位末端均添加EcoRv和NheI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。引物序列如下

gB-F:gatatcATTGTTCAATCATGATGTCCA(SEQ ID NO:5)

gB-R:gctagcGAGTTCCACCGACCGTATGA(SEQ ID NO:6)

PCR擴(kuò)增(50μL反應(yīng)體系)：以含有提前的基因組基因?yàn)槟０?，吸?.5mL PCR反應(yīng)管中，以引物gB-F和gB-R擴(kuò)增gB啟動(dòng)子基因，具體操作方法如下：

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后切割含目的大小片段的凝膠，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收純化后與pCR-2.1T載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切鑒定正確后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，將序列測(cè)定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名HgB(圖2)。

步驟三、MHCⅠss/MITD的合成

MHCⅠss/MITD的序列在參考已發(fā)表的文獻(xiàn)(Guillemot,Franpois等，1988)基礎(chǔ)上，在MHCⅠss的5’端添加NheⅠ酶切位點(diǎn)和kozak序列(GCCACC)，同時(shí)在MITD的3’端添加Kpn II酶切位點(diǎn)，交由南京金斯瑞公司合成，并分別連接到UC57上。

步驟四、OHA的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和刪除

使用SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)預(yù)測(cè)分析跨膜及胞內(nèi)區(qū)(TM)，刪除OHA的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的第525至第561位氨基酸，僅保留第1至第524位的胞外抗原區(qū)。刪除跨膜胞內(nèi)區(qū)的OHA命名為OHA-TM。

步驟五、Over-lapPCR連接MHCⅠss/MITD與OHA-TM

設(shè)計(jì)引物將，使用over-lapPCR將MHCⅠss/MITD與OHA-TM連接起來(lái)組成一個(gè)嵌合抗原。PCR后膠回收并測(cè)序驗(yàn)證，連接后的嵌合抗原序列如SEQIDNO:2所示。將其命名為MOHA。

引物設(shè)計(jì)如下

MHCⅠss-F：GCTAGCGCCACCATGGGGCCGTGCG(SEQ ID NO:7)

MHCⅠss-R：CTGTGTGTTCATGGGGGCCGCCGC(SEQ ID NO:8)

OHA-TM-F：GCGGCGGCCCCCATGAACACACAGATCCTGGT(SEQ ID NO:9)

OHA-TM-R：GTGGCGGCTCCACATCTTTGTACCCGGAGC(SEQ ID NO:10)

MITD-F：TACAAAGATGTGGAGCCGCCACAGCCCAAC(SEQ ID NO:11)

MITD-R：TCCGGATTAGATGGCGGGGTTGCTC(SEQ ID NO:12)

PCR反應(yīng)體系同上。

步驟六、中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建

將MOH使用Nhe I和Kpn II雙酶切，電泳后膠回收備用。將pCMGFP使用EcoRv和Nhe I雙酶切后，電泳膠回收備用。在專利CN105002146A中所構(gòu)建帶有同源臂的中間質(zhì)粒pCMGFP基礎(chǔ)上(圖1)，將將MOHA和HgB分別替換到上述質(zhì)粒，并將測(cè)序鑒定好的陽(yáng)性質(zhì)粒重新命名為pHgB-MOHA。

步驟七、WPRE元件的插入

插入在外源抗原基因片段3’端的WPRE(土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，SEQIDNO:4)能夠無(wú)物種特異性的增強(qiáng)基因表達(dá)水平和抗原表達(dá)水平。WPRE元件擴(kuò)增自Bac-HAMW(Chen,Chi-Yuan,et al."Baculovirus vector as an avian influenza vaccine:hemagglutinin expression and presentation augment thevaccineimmunogenicity."Journal of biotechnology 164.1(2013):143-150.)，由臺(tái)灣清華大學(xué)陳育誠(chéng)教授饋贈(zèng)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增WPRE的引物，并在上游5’端添加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)和下游3’端添加KnpI的酶切位點(diǎn)。引物序列如下

WPRE-F：ccgctcgagCGATAATCAACCTCTGGATTAC(SEQ ID NO:13)

WPRE-R：ttaggtaccCAAAGGGAGATCCGACTCGT(SEQ ID NO:14)

擴(kuò)增后的WPRE元件電泳后膠回收，并使用XhoI和KnpI雙酶切中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHMOH和擴(kuò)增的WPRE元件。膠回收后，T4連接酶16℃連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化后挑斑鑒定，將陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pHMW(圖2)。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切(圖3)和測(cè)序鑒定。

步驟八、重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建和純化

(1)rHVT-GFP感染細(xì)胞DNA的制備

原代和次代CEF細(xì)胞按常規(guī)方法制備，在每瓶T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶的次代CEF中接種105空斑形成單位(PFU)的重組rHVT-GFP病毒株、培養(yǎng)3-5天、等80％細(xì)胞產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變后收獲細(xì)胞、按照傳統(tǒng)的酚氯仿方法提取HVT基因組。

(2)轉(zhuǎn)移載體pHMW和rHVT-GFP基因組DNA共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提轉(zhuǎn)移載體pHMW質(zhì)粒DNA。CEF按常規(guī)方法制備，在開(kāi)始轉(zhuǎn)染試驗(yàn)1h前制備次代CEF，每個(gè)60mm培養(yǎng)皿鋪3x10⁶細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。

在無(wú)菌的指形管中依次加入以下試劑：

同時(shí)需設(shè)不加轉(zhuǎn)移載體pCMGFP質(zhì)粒的HVT對(duì)照組，體系如下：

無(wú)菌超純水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

TE 補(bǔ)足至25μL

混勻上述體系后，從管底緩慢加入31μL 2mol/L CaCl2溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na2HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管輕輕從管底吹出數(shù)個(gè)氣泡，室溫靜置30min，形成CaP04-DNA混合物。向每個(gè)鋪有次代CEF細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入500μL CaP04-DNA復(fù)合物，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄掉培養(yǎng)基，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的體系按如下：

無(wú)菌超純水 0.9mL

甘油 0.35mL

2xHBSP 1.25mL

混勻上述體系后作用1min后棄掉休克液，用維持液(V)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，棄掉洗滌液，加入含4％胎牛血清的生長(zhǎng)液(G)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5-7d后用倒置熒光顯微鏡觀察。

(3)重組病毒rHMW的篩選和純化

將轉(zhuǎn)染后的CEF用倒置熒光顯微鏡觀察，標(biāo)記出不帶有綠色熒光的病毒空斑。棄掉培養(yǎng)基，用帶有少許胰酶的吸管刮取病毒空斑，轉(zhuǎn)移至10mL生長(zhǎng)液(G)培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋，每一個(gè)病毒空斑接種一塊已鋪次代CEF細(xì)胞的96孔板，每孔接種l00μL稀釋的病毒空斑，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟，直到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上所有的病毒空斑都不帶有綠色熒光，并且組成每個(gè)病毒空斑的細(xì)胞都不帶有熒光，說(shuō)明重組病毒純化完全，將該重組病毒命名為rHMW。外源基因MOHA的插入到HVT上的位點(diǎn)同專利CN105002146A。

步驟九、重組火雞皰疹病毒的鑒定

間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)rHMW對(duì)外源抗原的表達(dá)：以rHMW感染次代CEF細(xì)胞，3-5天形成病毒空斑。

(1)收取細(xì)胞，使用試劑盒抽提DNA后，在同源臂上設(shè)計(jì)引物，PCR鑒定，并測(cè)序鑒定。PCR反應(yīng)條件同上，PCR結(jié)果如圖4所示。引物設(shè)計(jì)如下：

A-F：GCCGATAATTTGATATACGCAC(SEQ ID NO:15)

B-R：ATCTTCCACAGCTCCAGTTATT(SEQ ID NO:16)

(2)用冷甲醇固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌3次；加工作濃度的抗AIV HA多克隆抗體(H7血清)，37℃作用1小時(shí)，PBS洗滌2-3次；加工作濃度的抗雞IgG/lgM熒光單抗，37℃作用1小時(shí)，用PBS洗滌2-3次；置熒光鏡下觀察，結(jié)果表明組成病毒空斑的所有細(xì)胞均帶熒光(圖5)。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHMW及構(gòu)

建方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacacac agatcctggt gttcgccctg attgctatca ttcccactaa tgctgacaag 60

atctgcctgg ggcaccacgc agtgagcaac ggcaccaaag tgaataccct gacagagaga 120

ggagtggaag tggtgaacgc aactgagacc gtggaaagga ctaatatccc tcgcatttgc 180

agcaagggga agaaaaccgt ggatctgggc cagtgcggac tgctggggac aatcactggc 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttt agcgctgatc tgatcattga gagaagggaa 300

ggatccgacg tgtgctaccc tgggaagttc gtgaacgagg aagcactgcg gcagatcctg 360

agagagagcg gcggaattga taaagaagcc atggggttta cttactccgg catcagaacc 420

aatggagcaa ccagcgcatg caggaggtcc gggagctcct tctacgccga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa tgccgctttt ccccagatga ctaagagcta caaaaacacc 540

agaaaatccc ctgccctgat cgtgtggggc attcaccaca gcgtgtccac agctgaacag 600

actaagctgt acggaagcgg gaacaaactg gtgacagtgg gaagctccaa ttaccagcag 660

agcttcgtgc catccccagg agcaaggcca caggtgaacg gactgagcgg ccgcatcgac 720

tttcactggc tgatgctgaa ccctaatgat accgtgacat tcagctttaa tggcgctttc 780

atcgcaccag accgggcttc ctttctgaga ggcaagagca tgggaattca gtccggggtg 840

caggtggacg caaactgcga gggagattgc taccacagcg ggggcacaat catttccaac 900

ctgccattcc agaatatcga tagcagggca gtgggaaagt gcccaagata cgtgaaacag 960

cgctccctgc tgctggctac tggaatgaag aacgtgcctg agatcccaaa aggccgggga 1020

ctgttcggcg ctatcgcagg atttattgag aacgggtggg aaggcctgat tgacggatgg 1080

tacgggttta gacaccagaa tgctcagggg gagggcacag cagccgacta caagagcact 1140

cagtccgcaa tcgatcagat taccggaaag ctgaacaggc tgatcgaaaa aacaaatcag 1200

cagttcgagc tgattgacaa cgaatttaat gaggtggaaa aacagatcgg gaacgtgatt 1260

aattggaccc gcgatagcat cacagaagtg tggtcctaca acgccgagct gctggtggct 1320

atggaaaatc agcacaccat tgacctggcc gatagcgaga tggacaagct gtacgaaaga 1380

gtgaaaaggc agctgcgcga gaacgctgag gaagatggaa ccgggtgctt cgaaatcttt 1440

cacaagtgcg atgacgattg catggcaagc attaggaaca atacatacga tcactccaaa 1500

taccgggagg aagccatgca gaacagaatc cagattgacc ctgtgaagct gagctccggg 1560

tacaaagatg tgatcctgtg gttcagcttt ggcgcatcct gcttcatcct gctggccatt 1620

gtgatgggcc tggtgtttat ttgcgtgaag aacggaaata tgcgctgcac aatctgcatt 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggggccgt gcggggcgct gggcctgggg ctgctgctcg ccgccgtgtg cggggcggcg 60

gcccccatga acacacagat cctggtgttc gccctgattg ctatcattcc cactaatgct 120

gacaagatct gcctggggca ccacgcagtg agcaacggca ccaaagtgaa taccctgaca 180

gagagaggag tggaagtggt gaacgcaact gagaccgtgg aaaggactaa tatccctcgc 240

atttgcagca aggggaagaa aaccgtggat ctgggccagt gcggactgct ggggacaatc 300

actggccccc ctcagtgcga ccagttcctg gagtttagcg ctgatctgat cattgagaga 360

agggaaggat ccgacgtgtg ctaccctggg aagttcgtga acgaggaagc actgcggcag 420

atcctgagag agagcggcgg aattgataaa gaagccatgg ggtttactta ctccggcatc 480

agaaccaatg gagcaaccag cgcatgcagg aggtccggga gctccttcta cgccgagatg 540

aagtggctgc tgagcaacac cgacaatgcc gcttttcccc agatgactaa gagctacaaa 600

aacaccagaa aatcccctgc cctgatcgtg tggggcattc accacagcgt gtccacagct 660

gaacagacta agctgtacgg aagcgggaac aaactggtga cagtgggaag ctccaattac 720

cagcagagct tcgtgccatc cccaggagca aggccacagg tgaacggact gagcggccgc 780

atcgactttc actggctgat gctgaaccct aatgataccg tgacattcag ctttaatggc 840

gctttcatcg caccagaccg ggcttccttt ctgagaggca agagcatggg aattcagtcc 900

ggggtgcagg tggacgcaaa ctgcgaggga gattgctacc acagcggggg cacaatcatt 960

tccaacctgc cattccagaa tatcgatagc agggcagtgg gaaagtgccc aagatacgtg 1020

aaacagcgct ccctgctgct ggctactgga atgaagaacg tgcctgagat cccaaaaggc 1080

cggggactgt tcggcgctat cgcaggattt attgagaacg ggtgggaagg cctgattgac 1140

ggatggtacg ggtttagaca ccagaatgct cagggggagg gcacagcagc cgactacaag 1200

agcactcagt ccgcaatcga tcagattacc ggaaagctga acaggctgat cgaaaaaaca 1260

aatcagcagt tcgagctgat tgacaacgaa tttaatgagg tggaaaaaca gatcgggaac 1320

gtgattaatt ggacccgcga tagcatcaca gaagtgtggt cctacaacgc cgagctgctg 1380

gtggctatgg aaaatcagca caccattgac ctggccgata gcgagatgga caagctgtac 1440

gaaagagtga aaaggcagct gcgcgagaac gctgaggaag atggaaccgg gtgcttcgaa 1500

atctttcaca agtgcgatga cgattgcatg gcaagcatta ggaacaatac atacgatcac 1560

tccaaatacc gggaggaagc catgcagaac agaatccaga ttgaccctgt gaagctgagc 1620

tccgggtaca aagatgtgga gccgccacag cccaacctgg tgcccatcgt ggcgggggtg 1680

gccgtcgcca ttgtggccat tgccatcatg gttggtgttg gattcatcat ctacagacgc 1740

catgcaggga agaaggggaa gggctacaac atcgcgcccg ggagcaaccc cgccatctaa 1800

<210> 3

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcgttttgc ccaaccctcg aatacggctt tatatttcag tgtggaaaat gtaggcctcc 60

tgcctcactt gaaggaagaa atggcacgat ttatgttaca gtgcaacaac acatcaagtt 120

ggataataag taaatttagg gggttttacg attttggtgg agtggataat ataaccaccg 180

cacatagaat ggcatggaaa tatatacgag agttgatttt ggcgactgcc ctttttgcat 240

ccgtgttcaa atgtggcgat ttgcaggtgt gtcgtgccga tggcttacag ctaacattgg 300

ggggggagta catttgggag gatggagtat atctgacata cgagaccgat tgtcctctcg 360

tagcacttat cgggtgtagg gcttatctaa cccacaatca atccccgacc gttctcgttg 420

acacggatgt tttttccttg ctttattcta ttttgcagtt tatggctccc gctacggcgg 480

atcagttacg atcggatcgg tttagtaata gccacaccca caattgacct aggtcaatat 540

cgttaggact ttagtatttt gattcatacg gtcggtggaa ctcatgctta tgactcctac 600

aatgaagtac tttaatcggt ctttatttat ttttctcacc ccaatcttat ccatcgcgac 660

ctcagaaatt aaattaccaa atgtgacagc gcgagaaatt gtttcgggca tacagctatc 720

cgaagacgag acgacatttt ac 742

<210> 4

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 60

tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 120

ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 180

gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 240

cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 300

ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 360

gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct 420

gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 480

cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 540

tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttg 579

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatatcattg ttcaatcatg atgtcca 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctagcgagt tccaccgacc gtatga 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctagcgcca ccatggggcc gtgcg 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgtgtgttc atgggggccg ccgc 24

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcggcggccc ccatgaacac acagatcctg gt 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtggcggctc cacatctttg tacccggagc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tacaaagatg tggagccgcc acagcccaac 30

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tccggattag atggcggggt tgctc 25

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccgctcgagc gataatcaac ctctggatta c 31

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttaggtaccc aaagggagat ccgactcgt 29

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccgataatt tgatatacgc ac 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atcttccaca gctccagtta tt 22