本發明涉及一種利用淡水魚加工副產物——魚皮，提取酸溶性膠原蛋白及其制備方法，屬于水產加工技術領域，產品可應用于功能食品、生物醫藥、化妝品、皮革、照相等領域。
背景技術：
以下對本發明的相關技術背景進行說明，但這些說明并不一定構成本發明的現有技術。
膠原蛋白或稱膠原(collagen)是很多脊椎動物和無脊椎動物體內含量最豐富而且是分布最廣的蛋白質。它屬于結構蛋白質，能使腱、骨、軟骨、牙、皮和血管等結締組織具有機械強度，起著支撐器官和保護機體的功能。同時膠原蛋白也是一種重要的功能性蛋白質，它與細胞增殖、分化、遷移、免疫、關節潤滑、傷口愈合等密切相關。由于膠原蛋白的特殊功能，膠原蛋白的應用已經涉及到醫療器械、藥品、照相、化妝品、日用化學品工業、功能性食品制造等領域。
目前，制備膠原蛋白的原料主要是陸生哺乳動物，如豬、牛的皮和骨，但是由于瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發使人們對陸生哺乳動物膠原蛋白制品的安全性產生了疑慮；另一方面，由于宗教方面(清真和猶太教)的原因，一部分人排斥或拒絕使用從豬身上獲得的膠原產品，即使是以牛為原料制得的產品也需要符合清真和猶太教的相關規定，這使得傳統來源膠原蛋白的應用受到限制。因此，尋找豬、牛皮和骨以外的原料提取制備膠原蛋白的需求已顯得越來越迫切，而水產動物來源的膠原蛋白就成為哺乳動物來源膠原蛋白理想和現實的替代產品，以水產動物皮、骨等為原料提取的膠原蛋白因其獨特的功能和特性而成為研究的熱點。我國養殖魚類特別是淡水魚的養殖產量多年來一直位居世界首位，隨著水產品加工業的發展，具有大量的魚皮資源，從水產品加工副產物中提取膠原蛋白并加以利用，具有較大的開發前景。
現有技術中，膠原蛋白的提取及制備方法主要有酸法、酶法、堿法、中性鹽法及聯合法，其中酸法、酶法和酸酶結合法比較常用。由于魚類的多樣性以及魚皮組織與豬、牛等哺乳動物皮組織的結構和組成的不同，針對淡水魚魚皮的結構和化學組成的特點，需尋找新的方法，高效提取淡水魚皮中的膠原蛋白，并最大程度的保持膠原蛋白的天然結構和活性。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種利用乳酸高效提取淡水魚皮中膠原蛋白的方法，以克服現有技術從魚皮中提取膠原蛋白的方法所存在的提取產率低，產品質量差等不足，所制備的膠原蛋白可用于食品、化妝品、生物醫學等領域。與通常所用的膠原蛋白提取方法相比，本發明所述方法工藝簡單，操作性強，可以大大提高膠原蛋白提取率，改善產品質量。
利用乳酸提取淡水魚皮膠原蛋白的方法，包括以下提取步驟：
(1)以冷凍魚皮或新鮮魚皮為原料(冷凍魚皮需提前解凍)，去除魚皮上的魚鱗、殘余碎肉及皮下組織，洗凈；
(2)洗凈的魚皮整塊浸于酸性溶液中12小時，去除魚皮中的糖胺聚糖；
(3)用水將魚皮清洗至pH中性，并剪成1×1cm2的碎片，然后將魚皮加入到堿性溶液中浸泡12小時，去除雜蛋白；
(4)用水將魚皮清洗至pH中性，過濾后，將魚皮浸泡于正己烷中12小時，脫脂；
(5)將魚皮洗凈后，瀝去水分，用乳酸溶液浸提魚皮膠原蛋白，提取后離心分離上述體系，收集上清液，然后將沉淀物用乳酸溶液進行二次浸提，離心分離，將二次所得上清液合并；
(6)向上清液中加入NaCl至最終濃度為0.4～1.0M，攪拌鹽析。鹽析后離心取沉淀用0.5M醋酸溶解，溶解液采用超濾脫鹽和濃縮，將超濾截留液冷凍干燥，即可得到白色、無腥味的膠原蛋白固體。
與現有技術相比，本發明的優點是：
1.針對淡水魚魚皮的組成特點，采取適宜的預處理和提取方法。所使用的方法能夠最大限度的除去雜質而不影響膠原蛋白，同時能有效的脫除魚腥味和色素，使膠原蛋白產品質量更好。
2.整個提取過程均在低溫下進行(清洗用4℃預冷水，其他過程溫度均保持在10℃以下)，以保證膠原蛋白結構的完整性和生物活性。
3.以乳酸溶液的pH作為控制酸提取膠原蛋白過程的主要工藝參數，與常用的酸溶液濃度相比，控制溶液的pH更直觀、更容易，更適合于工業化生產中的過程監控，且與控制濃度參數所達到的效果沒有顯著差異。
4.采用二次提取，最大限度的提取魚皮中的膠原蛋白，提高原料的利用率，提取的膠原蛋白為無酸味、無腥味的潔白海綿狀固體。
具體實施方式
下文將通過提供一些具體的實施方式以舉例方式對本發明進行進一步的描述。但是本申請請求保護的技術方案不限于這些具體的實施方式。
本發明提供一種利用乳酸高效提取淡水魚皮中膠原蛋白的方法，包括以下提取步驟：
(1)以冷凍魚皮或新鮮魚皮為原料(冷凍魚皮需提前解凍)，去除魚皮上的魚鱗、殘余碎肉及皮下組織，洗凈；
(2)洗凈的魚皮整塊浸于酸性溶液中12小時，去除魚皮中的糖胺聚糖；
(3)用水將魚皮清洗至pH中性，并剪成1×1cm2的碎片，然后將魚皮加入到堿性溶液中浸泡12小時，去除雜蛋白；
(4)用水將魚皮清洗至pH中性，過濾后，將魚皮浸泡于正己烷中12小時，脫脂；
(5)將魚皮洗凈后，瀝去水分，用乳酸溶液浸提魚皮膠原蛋白，提取后離心分離上述體系，收集上清液，然后將沉淀物用乳酸溶液進行二次浸提，離心分離，將二次所得上清液合并；
(6)向上清液中加入NaCl至最終濃度為0.4～1.0M，攪拌鹽析。鹽析后離心取沉淀用0.5M醋酸溶解，溶解液采用超濾脫鹽和濃縮，將超濾截留液冷凍干燥，即可得到白色、無腥味的膠原蛋白固體。
在一些實施方式中，步驟(3)中所述酸性溶液的pH為2～3，例如為pH2、pH2.5或pH3；在一些優選的實施方式中，所述酸性溶液為乳酸或醋酸水溶液，特別優選的是乳酸水溶液。
在一些實施方式中，步驟(4)中所述堿性溶液的濃度為0.1～0.6M，例如為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6M；在一些優選的實施方式中，所述堿性溶液為氫氧化鈉或碳酸鈉水溶液，特別優選是氫氧化鈉水溶液。
在一些實施方式中，步驟(3)和(4)中所述酸性溶液和堿性溶液的用量優選為魚皮和酸或堿性溶液的固液比(g/mL)為1:7～1:10，例如為1:7、1:8、1:9或1:10。
在一些實施方式中，步驟(5)中所述乳酸溶液以pH計，乳酸溶液pH值優選為1.8～3.0，例如為1.9、2.1、2.3、2.5、2.7或3.0。與常用于提取膠原蛋白的醋酸相比，乳酸的刺激性氣味較小，性質溫和，熔點高，低溫下不易結晶，更適用于膠原蛋白在低溫條件下的提取。雖然乳酸價格較醋酸高，但由于本發明中酸溶液是以pH計，配制同體積同pH的酸溶液，乳酸的用量遠少于醋酸，可彌補其價格高的缺陷。
在一些實施方式中，步驟(5)中第一次提取魚皮和乳酸溶液的固液比(g/mL)為1:4～1:8，例如為1:4、1:5、1:6、1:7或1:8；第二次提取魚皮和乳酸溶液的固液比(g/mL)固定為1:6。如果固液比小，提取不充分，造成提取率低；如果固液比過大，則總處理量較大，可能會使提取成本增加。
在一些實施方式中，步驟(5)中乳酸溶液第一次提取時間為12～60小時，例如為12、24、36、48或60小時；第二次提取時間為6～12小時，例如為6、8、10或12小時。如果提取時間短，提取不充分，造成膠原蛋白提取率低；如果提取時間過長，則會使膠原蛋白小部分降解，且降低生產效率，增加生產成本。
在一些實施方式中，步驟(6)中采用超濾對鹽析后膠原蛋白進行脫鹽和濃縮處理，超濾膜的截留分子量優選為大于5000道爾頓，例如截留分子量為5000、10000或20000道爾道。經鹽析提取的膠原蛋白，需進行脫鹽處理，實驗室常用透析進行脫鹽，耗時長且不徹底，不適合工業化生產。采用超濾脫鹽，效率更高，效果更好，且在脫鹽的同時對溶液進行濃縮，使后續膠原蛋白的冷凍干燥更容易進行。
實施例
下文將通過實施例的形式對本發明進行進一步的說明。
實施例1
預處理：以冷凍羅非魚皮為原料，魚皮4℃解凍24小時。解凍后清洗，去除魚皮表面的魚鱗、碎肉和結締組織，pH2的乳酸溶液浸泡，洗凈，然后將魚皮切成小片，0.1M NaOH溶液浸泡12小時后，洗凈，正己烷浸泡12小時，洗凈，瀝去水分。
提取：按固液比(g/mL)1︰7加入pH2.1的乳酸溶液，浸提48小時后離心，收集上清液，沉淀部分按固液比1︰6，加入pH2.1的乳酸溶液再次浸提12小時后離心，合并兩次所得上清液，加入NaCl至最終濃度0.7～1.0M進行鹽析，取鹽析后沉淀用0.5M醋酸溶解沉淀，溶解液用截留分子量大于10000道爾頓的超濾膜進行脫鹽和濃縮，超濾截留液冷凍干燥，即得到膠原蛋白，膠原蛋白提取率為84.3％。
實施例2
預處理：以冷凍斑點叉尾鮰魚皮為原料，魚皮4℃解凍24小時。解凍后清洗，去除魚皮表面的碎肉、皮下脂肪和結締組織，pH2的乳酸溶液浸泡，洗凈，然后將魚皮切成小片，0.1M NaOH溶液浸泡12小時后，洗凈，正己烷浸泡12小時，洗凈，瀝去水分。
提取：按固液比(g/mL)1︰5加入pH2.3的乳酸溶液，浸提36小時后離心，收集上清液，沉淀部分按固液比1︰6，加入pH2.3的乳酸溶液再次浸提10小時后離心，合并兩次所得上清液，加入NaCl至最終濃度0.7～1.0M進行鹽析，取鹽析后沉淀用0.5M醋酸溶解沉淀，溶解液用截留分子量大于20000道爾頓的超濾膜進行脫鹽和濃縮，超濾截留液冷凍干燥，即得到膠原蛋白，膠原蛋白提取率為65.4％。
實施例3
預處理：以新鮮白鰱魚皮為原料，清洗，去除魚皮表面的魚鱗、碎肉和結締組織，pH2的乳酸溶液浸泡，洗凈，然后將魚皮切成小片，0.5MNa2CO3溶液浸泡12小時后，洗凈，正己烷浸泡12小時，洗凈，瀝去水分。
提取：按固液比(g/mL)1︰6加入pH1.9的乳酸溶液，浸提48小時后離心，收集上清液，沉淀部分按固液比1︰6，加入pH1.9的乳酸溶液再次浸提8小時后離心，合并兩次所得上清液，加入NaCl至最終濃度0.7～1.0M進行鹽析，取鹽析后沉淀用0.5M醋酸溶解沉淀，溶解液用截留分子量大于5000道爾頓的超濾膜進行脫鹽和濃縮，超濾截留液冷凍干燥，即得到膠原蛋白，膠原蛋白提取率為71.9％。
實施例4
預處理：以冷凍羅非魚皮為原料，魚皮4℃解凍24小時。解凍后清洗，去除魚皮表面的魚鱗、碎肉和結締組織，pH2.5的醋酸溶液浸泡，洗凈，然后將魚皮切成小片，0.1M NaOH溶液浸泡12小時后，洗凈，正己烷浸泡12小時，洗凈，瀝去水分。
提取：按固液比(g/mL)1︰7加入pH2.1的乳酸溶液，浸提24小時后離心，收集上清液，沉淀部分按固液比1︰6，加入pH2.1的乳酸溶液再次浸提12小時后離心，合并兩次所得上清液，加入NaCl至最終濃度0.7～1.0M進行鹽析，取鹽析后沉淀用0.5M醋酸溶解沉淀，溶解液用截留分子量大于10000道爾頓的超濾膜進行脫鹽和濃縮，超濾截留液冷凍干燥，即得到膠原蛋白，膠原蛋白提取率為70.3％。
雖然參照示例性實施方式對本發明進行了描述，但是應當理解，本發明并不局限于文中詳細描述和示出的具體實施方式，在不偏離權利要求書所限定的范圍的情況下，本領域技術人員可以對所述示例性實施方式做出各種改變。