一株耐高鹽耐高COD鹽水球菌菌株和來源該菌株的內源質粒的制作方法

文檔序號：12166727閱讀：623來源：國知局

本發明涉及廢水處理技術領域，尤其涉及一種耐高鹽耐高COD鹽水球菌處理廢水技術領域。

背景技術：

鹽水球菌屬Salinicoccus的分類地位隸屬于細菌域真細菌界硬壁菌門芽孢桿菌綱芽孢桿菌目葡萄球菌科，是一類能夠耐受或嗜好輕度或中度鹽環境的微生物。根據LPSN(List of prokaryotic names with standing in nomenclature)數據庫的統計結果，目前Salinicoccus屬有15個種，分別是S.albus，S.alkaliphilus，S.amylolyticus，S.carnicancri，S.halitifaciens，S.halodurans，S.hispanicus，S.iranensis，S.jeotgali，S.kekensis，S.kunmingensis，S.luteus，S.qingdaonensis，S.roseus，S.salitudinis，S.salsiraiae，S.sesuvii，S.siamensis。鹽水球菌分布廣泛，目前已報道的樣品來源包括鹽場，鹽堿湖，鹽礦，沿海海水，海洋沉積物，荒漠土，鹽漬土，鹽巖層，柴達木盆地，海馬齒根際，發酵的海鮮，鹽冰場等。

鹽水球菌能產生多種耐高鹽的胞外水解酶，如蛋白酶，脂肪酶等，這些耐鹽的蛋白資源具有重要的應用前景。Salinicoccus sp.strain QW6(后命名為S.iranensis)，具有亞碲酸鹽耐受和降解能力，經過優化亞碲酸鹽(0.005-0.5mM)降解率達99％；從這株菌中分離到由三個亞基組成的亞碲酸鹽還原相關的酶系。亞碲酸降解菌及其還原酶系的分離鑒定，不僅為微生物消除毒性無機物提供了新的見解，而且在廢水治理方面具有潛在的應用價值。除此之外，Salinicoccus halodurans H3B36能夠在胞內富集N(α)-acetyl-α-lysine，用以抵抗高鹽和高溫，這也是一種具有潛在應用價值的相容性溶質。

除提供重要的代謝產物、基因和蛋白資源外，鹽水球菌本身作為生產菌株，也具有廣闊的應用前景。鹽水球菌能夠耐受高鹽環境，其作為生產菌株，不需經過嚴格的滅菌消毒過程。Salinicoccus roseus W12能夠耐受高達20％的乳酸鹽，研究表明，交叉保護和能量代謝相關蛋白發揮重要功能；耐鹽耐有機酸的特性，使得鹽水球菌不僅在乳酸生產等微生物制造領域有廣闊的應用前景，而且在高鹽高COD廢水處理領域也具有潛在的應用價值。目前尚無鹽水球菌具有致病性的報道，而且其革蘭氏染色呈陽性，細胞破裂后不會釋放出脂多糖等免疫抗原，不會引起人類免疫反應。鹽水球菌的細胞是球形，具有更大的表面積體積比，也更利于物質的跨膜轉運。

目前應用于工業化生產的微生物，如不同大腸桿菌菌株的基因組大小為4.64M到5.5M之間，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因組大小為4.22M，Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的基因組大小為3.31M；具有良好產業化生產PHB前景的耐鹽細菌Halomonas sp.TD01的基因組的大小是4.09M。基因組中存在著大量的假基因和在工業生產中非必需的基因，這些基因的擴增需要大量的物質和能量，而且有些基因的產物可能對菌體生長帶來負面影響，所以有很多科學家嘗試通過基因工程將基因組上非必需的基因缺失，或通過理性設計構建最小基因組的菌株。目前有7株鹽水球菌菌株完成了基因組測序(來源NCBI數據庫)，基因組大小2.55M-2.78M不等，而本發明提供的鹽水球菌菌株，基因組只有2.24M(數據尚未發表)。相比于其他常用的生產菌株，鹽水球菌的基因組普遍偏小，如果將天然具有較小基因組的鹽水球菌發展成為工業生產的底盤細胞，可能具有不可替代的優勢。

但是，目前尚無鹽水球菌的遺傳工具和操作方法，極大地限制了其應用潛力的開發。挖掘利用鹽水球菌的遺傳資源，并進一步開發鹽水球菌的應用潛力，具有重要的實際意義。

技術實現要素：

鹽水球菌具有良好的耐高鹽高COD的特性，尤其是耐高鹽高濃度有機酸，使其在高鹽高COD廢水處理等領域具有潛在的產業價值。化工、制藥等生產過程會產生大量的高鹽高COD廢水，這類廢水的處理一直是水處理的重點和難點。纖維素醚的生產過程會排放大量的高鹽高有機酸廢水，而且纖維素醚應用范圍很廣，在我國產能很大。物理化學等處理方法可以實現部分高鹽廢水的脫鹽和降COD，但是處理成本高，而且會產生較嚴重的二次污染。

為了解決上述問題，本發明人經過大量實驗和文獻研究：生物處理認為是生態環保的處理方法。用耐高鹽高COD的微生物將COD降低、去除或轉化為有價值的產品，處理后的普通鹽水經脫鹽可獲得無機鹽或無機鹽水直接循環利用。鹽水球菌系統的構建就是為實現高鹽高COD廢水的廉價、環保處理。

本發明的目的之一是提供一株耐高鹽高COD的鹽水球菌菌株。一株耐高鹽高COD的鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408,保藏編號為CGMCC No.13032。

本發明提供的細菌分離自天津大港油田采油井附近儲油罐下方的土壤樣品，分離方法是經額外添加5％乙酸鈉鹽度10％的液體完全培養基富集培養兩次后，在相同培養基固體平板上劃線獲得單克隆，其實驗室內部編號為408。

經測定，該細菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達99％以上，由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408已于2016年9月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13032。

本發明提供鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度鹽度和高濃度乙酸鹽，在完全培養基中耐受NaCl濃度的范圍2-15％(培養基成分為：酸水解酪素7.5克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉1克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉20-150克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，pH調節到7.0-7.2)，能夠耐受高達5％的乙酸。

本發明的另一目的是提供一株鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE及其來源的兩個內源性質粒。

鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE已于2016年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13135。

本發明提供的兩個內源性質粒分離提取自鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中。兩個質粒均為環形質粒。

其中較小質粒的大小為2191bp，命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2)；較大質粒大小為3007bp，命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3)。

序列表中序列2由2191個核苷酸組成。其中，序列2中的自5′端第715-1641位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列4(由308個氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質粒復制所需的反式作用因子Rep1。

序列表中序列3由3007個核苷酸組成。其中，序列3中的自5′端第1067-2080位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列5(由337個氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質粒復制所需的反式作用因子Rep2。

質粒pS408-1的物理圖譜如圖1所示，其包括的常見限制性內切酶位點有BamHI，ClaI，PvuII酶切位點各一個。其中，序列2中的自5′端第1500-1505位堿基為BamHI酶切位點；序列2中的自5′端第323-328位堿基為ClaI酶切位點；序列2的自5′端第1019-1024位堿基為PvuII酶切位點。質粒pS408-1不含ApaI，BglII，EcoRI，EcoRV，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內切酶位點，因此這些內切酶位點可作為pS408-1的衍生載體的多克隆位點。

質粒pS408-2的物理圖譜如圖2所示，其包括的常見限制性內切酶位點有BamHI，ClaI，EcoRI，EcoRV酶切位點各一個。其中，序列3中的自5′端第1936-1941位堿基為BamHI酶切位點；序列3中的自5′端第2689-2694位堿基為ClaI酶切位點；序列3的自5′端第698-703位堿基為EcoRI酶切位點；序列3的自5′端第2821-2826位堿基為EcoRV酶切位點。質粒pS408-2不含ApaI，BglII，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，PvuII，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內切酶位點，因此這些內切酶位點可作為pS408-2的衍生載體的多克隆位點。

為了進一步探討質粒的應用范圍，對其拷貝數進行了測定。質粒pS408-1在對數期的拷貝數是0.90±0.13個，在穩定期的拷貝數是1.12±0.07個；質粒pS408-2在對數期的拷貝數是0.97±0.07個，在穩定期的拷貝數是1.21±0.12個。質粒pS408-1和pS408-2的拷貝數都在1-2個范圍內，均屬于低拷貝數的質粒。

本發明的又一目的是提供pS408-1和pS408-2的衍生質粒載體pTCS101和pTCS201。

由于質粒pS408-1和pS408-2能夠在鹽水球菌中自主復制，在保證其提供的復制所需的元件完整的前提下，向其中引入性質明確的其它功能DNA片段，或反過來將復制所需的元件完整的引入性質明確的其他功能DNA序列，即可構成可轉化鹽水球菌的衍生質粒。

本發明提供的衍生質粒是在pUCm-T的基礎上，首先連接入氯霉素抗性基因(方向為EcoRI到HindIII，質粒命名為pTC)，然后分別連接入質粒pS408-1的自5′端第1至2191位堿基或pS408-2的自5′端第1至3007位堿基至XbaI和HindIII位置，分別命名為pTCS101和pTCS201，物理圖譜如圖3和4所示。

這兩個衍生質粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復制所需的復制原點，都含有在大腸桿菌中復制所需的復制原點，和在大腸桿菌及在鹽水球菌中篩選轉化子的抗性選擇標記基因AmpR和CmR，是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質粒。

也對穿梭質粒在鹽水球菌中的拷貝數分別進行了測定。質粒pTCS101在對數期的拷貝數是3.52±0.61個，在穩定期的拷貝數是8.57±0.88個；質粒pTCS201在對數期的拷貝數是2.23±0.20個，在穩定期的拷貝數是5.34±0.35個。

以穿梭質粒pTCS101和pTCS201為基礎，引入適當的蛋白表達元件和目的基因，轉化鹽水球菌，以合適的條件培養即可得到足夠量的目的蛋白。如在pTCS101中克隆金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶編碼基因(Gene ID：3921373)和上下游功能序列，獲得的質粒命名為pTCS101-LDH；經電穿孔轉化至質粒消除株Salinicoccus sp.PE獲得乳酸脫氫酶成功表達的菌株Salinicoccus sp.PE(pTCS101-LDH)。因此，基于質粒pS408-1和pS408-2構建而成各種表達載體均在本專利保護之列。

由本發明的鹽水球菌質粒及其衍生質粒載體轉化所得到的微生物也屬于本發明的保護范圍。

本發明的鹽水球菌質粒載體為鹽水球菌的研究和開發提供了遺傳工具系統，將在鹽水球菌的研究和開發中發揮重要作用。

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

附圖說明

圖1質粒pS408-1的物理圖譜。

圖2質粒pS408-2的物理圖譜。

圖3質粒pTCS101的物理圖譜。

圖4質粒pTCS201的物理圖譜。

具體實施方式

下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1

鹽水球菌菌株的分離、制備、培養

本發明提供的細菌分離自天津大港油田采油井附近儲油罐下方的土壤樣品，分離方法是經額外添加5％乙酸鈉鹽度10％的液體完全培養基富集培養兩次后，在相同培養基固體平板上劃線獲得單克隆，其編號為408。

經測定，該細菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達99％以上，由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。菌株已于2016年9月22日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13032。

實施例2

鹽水球菌質粒pS408-1和pS408-2的提取、測序和特點

將鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408培養至穩定期，離心收集菌體，采用提取低拷貝數質粒的方法提取鹽水球菌質粒。質粒經限制性內切酶Sau3AI不完全酶切的DNA片段，連接入經BamHI(Sau3AI和BamHI是同尾酶)完全酶切的自連的pUCm-T載體，挑選有質粒片段連接入的質粒，測序；將獲得的序列拼接。以部分拼接的片段為模板，設計向外方向的測序引物，以提取的鹽水球菌質粒為模板測序，并進一步拼接質粒；最終獲得兩個環形質粒的DNA序列。

其中較小質粒的大小為2191bp，命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2)；自5′端第715-1641位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的質粒復制所需的反式作用因子Rep1，由308個氨基酸殘基組成。

較大質粒大小為3007bp，命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3)；自5′端第1067-2080位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的質粒復制所需的反式作用因子Rep2，由337個氨基酸殘基組成。

為了進一步探討質粒的應用范圍，對其拷貝數進行了測定。測定方法是采用Real-time PCR測定質粒相對于染色體的拷貝數。在質粒pS408-1上設計的一對引物為CPN-P1-F：AAAAGAGGAGCAGAAGG和CPN-P1-R：TTGCGTGATAAGTGGAT，在質粒pS408-2上設計的一對引物為CPN-P2-F：TTCGTCAGTCTCGGTGGT和CPN-P2-R：TTCGGTTACTCTTCCTCAAT，在染色體上單拷貝基因RNA聚合酶beta亞基編碼基因設計的一對引物為CPN-C-F：GAGACGGGCGAGGTTA和CPN-C-R：TTTCGACAGTTGGTGGTT。質粒pS408-1在對數期的拷貝數是0.90±0.13個，在穩定期的拷貝數是1.12±0.07個；質粒pS408-2在對數期的拷貝數是0.97±0.07個，在穩定期的拷貝數是1.21±0.12個。質粒pS408-1和pS408-2的拷貝數在1-2個范圍內，均屬于低拷貝數的質粒。

實施例3

大腸桿菌-鹽水球菌衍生質粒pTCS101和pTCS201的構建

用引物CmR-F：CAACTAAAGCACCCAT和CmR-R：TCGGCATTATCTCATA擴增氯霉素抗性基因(J Bacteriol.1984,158(2):543-50)，直接連接入pUCm-T載體，經藍白斑篩選和測序，獲得的質粒插入T載體的方向為EcoRI到HindIII，將其命名為pTC。

以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13032的基因組為模板，用引物P1-F：GATCCATTTATGCCGAG和P1-R：TCCGATGATTATATGGC擴增即可獲得pS408-1復制所需的完整的DNA序列；以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13135的基因組為模板，用引物P2-F：GATCTGTTTATGCCGAG和P2-R：ACTACCGTTTTATTTTC擴增即可獲得pS408-2復制所需的完整的DNA序列。

上述兩個鹽水球菌質粒復制所需的完整的DNA序列通過分別在上下游引物的5’端添加酶切位點，經酶切連接入pTC質粒；所選限制性內切酶分別為XbaI和HindIII。由pS408-1復制所需的完整的DNA序列連接入pTC質粒獲得衍生質粒pTCS101(物理圖譜如圖3所示)，由pS408-2復制所需的完整的DNA序列連接入pTC質粒獲得衍生質粒pTCS201(物理圖譜如圖4所示)。

這兩個衍生質粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復制所需的復制原點，都含有在大腸桿菌中復制所需的復制原點，和在大腸桿菌及鹽水球菌中篩選轉化子的抗性選擇標記基因AmpR和CmR，是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質粒。

實施例4

質粒消除菌株的獲得和穿梭質粒pTCS101和pTCS201的拷貝數

野生型鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408含有內源性質粒pS408-1和pS408-2，需將其消除掉。

首先將質粒pTCS101電穿孔法(參考FEMS Microbiol Lett.1992,73(1-2):133-138中金黃色葡萄球菌轉化方法)轉化到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中，在含有10μg/ml氯霉素的完全培養基中傳代培養兩次，基于質粒不相容性原理將pS408-1消除掉；然后再在無氯霉素的完全培養基中傳代培養兩次，通過影印平板法篩選獲得無氯霉素抗性的菌株，即獲得質粒pS408-1被消除的菌株。同理，在此基礎上再次消除掉質粒pS408-2，獲得質粒都被消除掉的菌株，即鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE。

將穿梭質粒pTCS101和pTCS201分別轉化到質粒消除的菌株Salinicoccus sp.PE中，測定穿梭質粒在鹽水球菌中的拷貝數。質粒pTCS101在對數期的拷貝數是3.52±0.61個，在穩定期的拷貝數是8.57±0.88個；質粒pTCS201在對數期的拷貝數是2.23±0.20個，在穩定期的拷貝數是5.34±0.35個。

實施例5

金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶基因在鹽水球菌中的表達

以金黃色葡萄球菌的基因組為模板，用引物LDH-SA-F：TGATTGGCTAGTTTGTA和LDH-SA-R：AGTTATTCCTCGTTGTC擴增即可獲得乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列。

上述乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列通過在上下游引物的5’端添加酶切位點，經酶切連接入pTCS101質粒；所選限制性內切酶分別為PstI和EcoRI。由乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列連接入pTCS101質粒獲得表達質粒pTCS101-LDH。

分別將空質粒pTCS101和乳酸脫氫酶表達質粒pTCS101-LDH分別轉入質粒消除鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE，得到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)。

在相同條件下培養菌體并制作蛋白粗提液。在有10μg/ml氯霉素鹽度5％的完全培養基中傳代培養至穩定期，收集10ml培養液的菌體，用緩沖液(50mM Tris Cl,150mM NaCl,pH7.5)洗滌兩次，最終重懸于1ml的緩沖液中。添加終濃度約為12U/ml溶葡球菌酶(購自生工生物工程上海(股份)有限公司)在37℃孵育1h，然后在低溫以200W功率按工作3s間隔6s的方式超聲破碎細胞，總超聲時間為10min，最后在低溫條件下12000rpm離心2min，上清轉移至新EP管，作為蛋白粗提液。

測定并比較鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的細胞粗提液中乳酸脫氫酶的比活力。

總蛋白質濃度采用北京普利萊基因技術有限公司生產的BCA蛋白定量試劑盒測定，測定結果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)的蛋白粗提液的總蛋白質濃度為3.65±0.01mg/ml，鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液的總蛋白質濃度為3.71±0.01mg/ml，二者蛋白濃度相當。

測定乳酸脫氫酶的方法為：首先配制底物混合液(1mM丙酮酸，0.75mM NADH，pH7.0～7.5)；上述重懸菌體的緩沖液350μl，底物混合液130μl，蛋白粗提液或其稀釋液20μl。

通過測定340nm吸光值的降低速率，代表底物NADH的消耗速率，計算比活力。測定結果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為0.42±0.10U/mg，鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為34.34±3.71U/mg，后者樣品中乳酸脫氫酶的比活力提高了近80倍，表明乳酸脫氫酶得到成功表達。

序列表

<110> 中國科學院微生物研究所

<120> 一株耐高鹽耐高COD鹽水球菌菌株和來源該菌株的內源質粒

<160> 7

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 1

cagtcgaacg cgcagccccg gagcttgctc cgggttctgc gagtggcgga cgggtgagta 60

acacgtaggc aacctaccca tcagactggg ataaccgcgg gaaaccgtgg ctaataccgg 120

atgatcctga tccccgcagg gggatgagtt gaaaggcggt ctttgactgc cactgatgga 180

tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaagggcc caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgcaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgtcaggga agaacgccgg tgggagtaac 420

tgtccatcgg gtgacggtac ctgaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg 540

ttcgttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggcg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg atgtgcgaaa 720

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agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctctgaccg 960

ccatggagac atggcttccc ttcggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc attagttgcc 1080

agcattcagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaggtta 1200

caaagggcag ctacgccgcg aggccaagcg aatcccataa aactgttctc agttcggatt 1260

ggagtctgca actcgactcc atgaagctgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca 1320

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cctgaagccg gtgggccaac ctttatggag gcagccgtcg aaggtgggac cgatga 1436

<210> 2

<211> 2191

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 2

gatccattta tgccgagaaa acttttggtg ggaaaagcaa ccctgaataa actaaaaagc 60

cggtaggcag ataccgtgag gtatcaaaaa tgcctaccga cagcttttgg gtttttaggg 120

ttgccgttgg ttcacaccaa aaggaaattg gaataaatat taatttactg tatcttctta 180

attaaaagga ggagattaca ttaataatag tttaaattta tttcttattg tttctttttt 240

ctttttgctt tacttaatat tttctgaagg aaattttgcc ttttttatat tattagcgtt 300

tgttcttttt gtatttttct taatcgataa tggtgaaaag gaaaatgttg atgataaaag 360

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aaagtgcaag tttttttgta tgcacctttc ttggtagaaa ggatttattc acttatggag 720

aagtataccc agaaaaagcg aaaaaatcaa ctgttacaga cactcatcag taagcatgtc 780

agcaaaaaga cactggaacg ggtaaaggac tgtaatacat tcttatttat ggtggctgat 840

attacgatgg aaaaaaccaa actacaccgt tccaataact gcgagcatcg gttctgtcca 900

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ctcaaaaaag aggagcagaa ggagtttctc tttctgactt tgacggcacc aaatgtgcca 1020

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aaagatcgag acgactatca tccgcatttt cacgtaatct tagccgctga taaacactat 1200

tttaataata aaagacaata tattaaacgc gatagatggc tcgaactctg gcaacaatca 1260

acaaaaaatc cacttatcac gcaagtggac atcagacgcg taaaacacac cgacaacaaa 1320

aaagaagtct ccgaaattgc caaatacagc gccaaagaca gcgactatct ccaagacgaa 1380

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<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

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ttgttattat gatataaacg aatggaacac agactatatg agtaggataa aaaagcaagt 780

ttctaaaaag acaataagca gatacttatt gtctttttag aacttgcttt tgaacttaga 840

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<212> PRT

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

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Glu Lys Thr Lys Leu His Arg Ser Asn Asn Cys Glu His Arg Phe

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110 115 120

Met Gln Arg Lys Glu Val Lys Thr Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

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<212> PRT

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

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Glu Lys Thr Lys Leu His Gly Ala Asn Ser Cys Lys His Arg Phe

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Cys Pro Val Cys Ser Trp Arg Lys Ser Arg Lys Asn Ala Leu Lys

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Ile Ser Ile Leu Met Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Glu Asn Lys Glu

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Met Glu Arg Lys Glu Val Lys Ala Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

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Met Tyr Lys His Arg Thr Asn Tyr Tyr Lys Lys Arg Gly Leu Asn

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185 190 195

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