本申請屬于生物醫學
技術領域：
，涉及干細胞定向誘導分化領域，具體涉及一種大鼠骨髓間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的優化方法。
背景技術：
：帕金森病(Parkinson’sdisease，簡稱PD)是常見于老年人的神經系統退行性疾病，其發病率僅次于阿爾茲海默病，位于第二位。一直是臨床治療的難點。目前認為其主要病因為腦中多巴胺能神經元的退行性變，大腦的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的藥物和手術療法能緩解疾病的早期臨床癥狀，但無法阻止或逆轉多巴胺能神經元退行性變，而且長期使用有明顯的副作用。干細胞的發現以及體外誘導分化為神經細胞的成功使得細胞移植替代治療成為可能。干細胞治療需要合適的種子細胞，并把種子細胞培養獲得適合移植使用的目標細胞，即多巴胺能神經元樣細胞。目前認為可能用于PD治療的干細胞來源包括胚胎干細胞(embryonicstemcells，簡稱ESCs)，神經干細胞(Neuralstemcells，簡稱NSCs)，間充質干細胞(mesenchymalstemcells，簡稱MSCs)等。胚胎干細胞體外向多巴胺能神經元分化已有報道(Buytaert-HoefenKA,AlvarezE,andFreedCR.GenerationoftyrosinehydroxylasepositiveneuronsfromhumanembryonicstemcellsaftercoculturewithcellularsubstratesandexposuretoGDNF.StemCells,2004.22(5):p.669-74.)。但是胚胎干細胞一般是來自于異源性組織的細胞，有免疫排斥的風險，并且倫理學爭議較多。神經干細胞，一般是來自于胚腦神經組織得到的，體外也可分化為大腦中幾乎所有類型的神經元，包括多巴胺能神經元(LieDC,etal.Theadultsubstantianigracontainsprogenitorcellswithneurogenicpotential.JNeurosci,2002.22(15):p.6639-49.)。但是神經干細胞相比胚胎干細胞分化潛能低，單一譜系方向分化效率也較低，同時來源有限，且有倫理學爭議。骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，在體外一定條件下可向神經細胞進行分化。并且骨髓間充質干細胞具有來源豐富、取材簡便、易分離純化、又可進行自體移植等特點，被認為是帕金森病等神經退行性疾病細胞替代療法的理想來源。目前體外誘導的方法主要分為3種：①神經營養因子和細胞因子，如維甲酸、腦源性神經營養因子、成纖維細胞生長因子等誘導分化。②化學試劑，二甲基亞砜、2-巰基乙醇、丁羥茴醚等誘導分化。③基因轉染或修飾的誘導分化。全骨髓培養得到的MSCs在體外合適條件和誘導因子作用12天可分化為表達多巴胺神經元標記物酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，簡稱TH)的神經元樣細胞，并具有一定的電生理活性，分化效率可達67％，是目前骨髓間充質干細胞能達到的最大分化率以及最短的誘導時間(TrzaskaKA,KuzhikandathilEV,RameshwarP,Specificationofadopaminergicphenotypefromadulthumanmesenchymalstemcells.StemCells,2007.25(11):p.2797-808.)。然而，目前技術難以通過體外誘導分化得到足夠數量的成熟多巴胺能神經元，而且移植后的細胞存活數量有限、移植細胞不易與原有神經網絡融合都在一定程度上限制了其臨床應用。因此，在細胞替代治療帕金森病，提高骨髓間充質干細胞定向誘導分化為多巴胺能神經元的分化效率是解決這些問題的關鍵。肝X受體(LiverXreceptor，LXR)是核受體家族中重要的一員，有α和β兩種亞型，LXRα除在肝臟高表達外，也在脂肪組織、腎、小腸、肺、腎上腺及巨噬細胞表達；LXRβ幾乎在所有的組織和器官內表達，尤其在腦。近年研究發現LXR在中樞神經系統中有重要功能，包括參與皮質板層神經元發育、維持運動神經元的存活、調節脂代謝、調節神經免疫以及參與突觸可塑性和軸突形成等多種生理功能。LXRα/β基因雙敲除小鼠顯示脂質在腦內逐漸累積，以及脊髓運動神經元和腹側中腦多巴胺能神經元的丟失(SacchettiP,etal.LiverXreceptorsandoxysterolspromoteventralmidbrainneurogenesisinvivoandinhumanembryonicstemcells.cellStemCell,2009.5(4):p.409-19.)然而，迄今未見有關LXR激動劑對體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞向多巴胺能神經元方向分化影響的報道。技術實現要素：有鑒于此，本申請針對上述存在的問題，提供了一種大鼠骨髓間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的優化方法。為了解決上述技術問題，本申請公開了一種大鼠骨髓間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的優化方法，骨髓間充質干細胞(MSCs)按20000個/ml密度接種，用Neurobasalmedium和B27supplement為基礎培養基，加入細胞因子SHH(250ng/ml)，FGF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)聯合0.5μMLXR激動劑(T0901317)共同誘導6天。與現有技術相比，本申請可以獲得包括以下技術效果：1)肝X受體作為靶點參與多巴胺能神經元的誘導分化及其機制。2)肝X受體激動劑聯合細胞因子SHH、FGF-8、bFGF可誘導骨髓間充質干細胞(MSCs)向多巴胺能神經元分化，提高了誘導分化率，并縮短了誘導時間，產生協同作用。3)肝X受體激動劑與其他誘導方法(如：化學試劑誘導，基因轉染，其他細胞因子等)聯用,可能促進誘導干細胞(如：胚胎干細胞、神經干細胞、臍帶間充質干細胞等)向多巴胺能神經元的誘導，分化與成熟。當然，實施本申請的任一產品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：圖1為倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代培養后的骨髓間充質干細胞(10×20)；其中(a)：原代培養；(b)：傳代培養后細胞呈典型的長梭形，漩渦狀生長；圖2為流式細胞儀檢測克隆化培養后的骨髓間充質干細胞表面標記物的流式圖；圖3為倒置相差顯微鏡觀察誘導后的骨髓間充質干細胞(10×20)；其中(a)：對照組細胞呈長梭形；(b)：處理組細胞胞體聚攏，并有突起；(c)：LXR組細胞胞體聚攏，并有突起；圖4為免疫熒光檢測誘導后多巴胺能神經元相關標記物Nestin的表達(×400)；其中(a)：對照組無神經標記物Nestin陽性表達；(b)與(c)：處理組和LXR組均有神經標記物Nestin陽性表達(紅色)；圖5為免疫熒光檢測誘導后多巴胺能神經元相關標記物Tuj1/TH的表達(×200)；其中(a)：對照組無多巴胺能神經元相關標記物Tuj1/TH陽性表達；(b)與(c)：處理組和LXR組均有多巴胺能神經元相關標記物Tuj1/TH陽性表達(紅色)；(d)：三組多巴胺能神經元相關標記物Tuj1/TH表達量比較；圖6為LXR激動劑對MSCs向TH陽性神經元分化方向分化的影響；圖7為熒光實時定量PCR檢測誘導后相關基因TH、Nurr1、Pitx3的相對表達量。具體實施方式以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。一、大鼠骨髓間充質干細胞分離培養和鑒定1、大鼠骨髓間充質干細胞的原代培養和傳代提取SD大鼠股骨和脛骨骨髓，移入20％FBS(v/v)培養基中培養。CO2培養箱(飽和濕度；95％air-5％CO2；37℃)中培養2天后全量換液，PBS洗2-3次去除懸浮未貼壁細胞。每2天換液一次，當細胞匯合度達70％-80％時，0.25％Trypsin-EDTA消化成單細胞懸液，1:2進行傳代，改用10％FBS培養基繼續培養。原代培養和傳代后培養的細胞形態見圖1所示。傳代培養方法：細胞長至70-80％匯合時傳代，用吸管吸去培養瓶內培養液，PBS清洗3次，0.25％Trypsin-EDTA消化至大部分細胞從底壁脫落，加入2ml10％FBS培養基中和胰酶，將細胞移至無菌離心管內，常溫下1500轉，離心5min，去上清，10％FBS培養基輕柔地將細胞吹打成單細胞懸液，1:2接種至新的無菌培養瓶中，置于CO2培養箱內繼續培養。擴增培養基成分如下：成分來源100ml含量DMEM/F-12Hyclone80ml,90mlFBSGibco20ml,10ml2、骨髓間充質干細胞的表面標記物檢測用流式細胞術鑒定骨髓間充質干細胞。取第3代大鼠BMSCs對數生長期的細胞，PBS清洗細胞3次，0.25％Trypsin-EDTA消化細胞，培養基終止消化并吹打至獲得單細胞懸液。取約106個細胞，按抗體說明書分別加入相應檢測量的熒光標記抗體(CD44-PE，CD29-FITC，CD90-PE，CD11b-PE，CD45-FITC)和相應的同型對照抗體，混勻，室溫避光放置30min。加入600μlPBS，1000g離心5min，棄上清，加入200μlPBS重懸細胞。流式細胞儀檢測。圖2為流式細胞儀檢測細胞表面標記物結果。可見：第3代大鼠BMSCs表達CD29，CD90，CD44，表達率分別為99.96％，98.47％，99.92％，不表達CD11b，CD45，表達率分別為0.71％，0.90％。二、定向誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化向多巴胺能神經元向分化1.定向誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化向多巴胺能神經元向分化將(一)中1步驟后的骨髓間充質干細胞(MSCs)按20000個/ml密度接種，分3組，即對照組、處理組和LXR組。處理組改用Neurobasalmedium和B27supplement為基礎培養基，加入細胞因子SHH(250ng/ml)，FGF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)作用12天不換液；LXR組在處理組的基礎上聯合0.5μMLXR激動劑(T0901317)同時加入并作用6天不換液；對照組不加誘導劑與LXR激動劑，采用10％FBS培養。均置于CO2培養箱(飽和濕度；95％air-5％CO2；37℃)中培養。鏡下觀察到一些MSCs在誘導劑作用下轉變為神經元樣形態，對照組細胞形態無明顯變化。見圖3。2.免疫熒光和定量PCR檢測誘導分化后細胞標記物表達。誘導分化后取出細胞爬片，4％多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗滌5mins*3次；非免疫性動物血清封閉，37℃30mins后PBS洗滌；按照抗體說明書所推薦濃度加入不同一抗(Nestin1:200；TH1:200與Tuj11:200共同孵育)，4℃孵育過夜，37℃復溫30mins后PBS洗滌5mins*3次；加入相應種屬及推薦濃度熒光標記的二抗(Abbcine)，37℃孵育30mins，PBS洗滌5mins*3次；室溫孵育DAIP5-7mins(碧云天)，PBS洗滌5mins*3次；50％甘油封片。分別置于NikonA1+R共聚焦顯微鏡相應激發光下觀察熒光。用NIS-ElementsAR4.2軟件計算TH與Tuj1熒光強度。誘導分化率＝TH陽性細胞/Tuj1陽性細胞。經過誘導后，骨髓間充質干細胞分化為多巴胺能神經元樣細胞，DAPI襯染細胞核(藍色),處理組和LXR組神經標記物Nestin均有陽性表達(紅色)；對照組則無陽性結果。見圖4。經過誘導后，骨髓間充質干細胞分化為多巴胺能神經元樣細胞，DAPI襯染細胞核(藍色),多巴胺能神經元相關標記物Tuj1(綠色)和TH(紅色)免疫熒光顯示，處理組和LXR組均有Tuj1(綠色)和TH(紅色)陽性表達；對照組則無陽性結果。與對照組比較，處理組Tuj1、TH熒光強度均顯著升高(**P<0.01)；與處理組比較，LXR組Tuj1、TH熒光強度均顯著升高(##P<0.01)。見圖5。免疫熒光結果顯示，對照組、處理組和LXR組TH染色陽性細胞數平均值分別為14.02％、62.61％和87.42％，與對照組比較，處理組TH染色陽性細胞數顯著升高(**P<0.01)；與處理組比較，LXR組TH染色陽性細胞數顯著升高(##P<0.01)。見圖6。3.定量PCR檢測誘導分化后細胞標記物表達q-PCR檢測：細胞總RNA的提取：使用TRIzol總RNA抽取試劑盒(日本TaKaRa公司)分別抽取細胞3組后的總RNA，分光光度計測抽提的RNA純度與濃度，保存于-80℃。cDNA的合成：逆轉錄體系：根據TaKaRa逆轉錄試劑盒的說明將逆轉錄體系配制如下：A去除gDNA的10ul體系：配好后室溫下放置5min。B20ul逆轉錄體系：冰上進行，反應液配好后輕柔混勻，立即開始逆轉錄反應，反應條件，37℃，15min；85℃，5sec；4℃冷卻。合成的cDNA置于-20℃保存。RT-PCR反應體系：根據TaKaRa逆轉錄試劑盒的說明將擴增體系配制擴增條件：95℃30sec+95℃5sec+60℃30-60sec收集熒光(40個循環)所用引物如下表所示：(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)結果的計算方法：采用相對定量ΔΔCt計算3組細胞基因的相對表達量。統計學處理：數據均用表示，設置差異顯著水平為雙側α＝0.05。采用軟件SPSS17.0做統計學分析，Dunnett’st檢驗做組間比較。誘導后檢測分化細胞中多巴胺能神經元發育相關基因TH、Nurr1、Pitx3的表達。GADPH作為內參。與對照組比較，處理組TH、Nurr1、Pitx3基因相對表達量均顯著升高(*P<0.05與**P<0.01)；與處理組比較，LXR組TH、Nurr1、Pitx3基因相對表達量均顯著升高(#P<0.05與##P<0.01)。見圖7。上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。當前第1頁1 2 3