本發明涉及一種綠藻寡糖的提取工藝，尤其是一種利用提取多糖后的綠藻廢液提取寡糖的工藝。
背景技術：
海藻是生長于海洋中的低等植物，是海洋生物的重要組成之一。
主要由褐藻、紅藻、綠藻、藍藻四大類海藻組成，其體內的生理活性物質研究已成為醫藥領域的熱點之一。其中，海藻多糖(seaweed polysaccharides)是目前最具有前景的一類生理活性物質。實驗和臨床已經發現海藻多糖具有免疫調節、降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗凝血及抗病毒等多種生理活性。
由于天然多糖常因分子量大、粘度高、溶解度低等，制約了其臨床應用。因此，必須改變海藻多糖的分子量，才能使海藻多糖發揮真正的作用。海藻寡糖（seaweed oligosaccharide）就是海藻多糖改變分子量后的高科技生物產品。
中國科學院海洋研究所的張燕霞教授指出“海藻寡糖又名低分子海藻多糖，其分子量通常在2000-8000Da，黏度在20CPS以下”（摘自百度文庫“海藻多糖和海藻寡糖的前景的生理活性物質”一文）。由于植物中天然存在的寡糖含量很低，通常被認為不能作為工業生產”，因此，目前的植物寡糖提取工藝為：以植物體的莖、葉等為原材料，經粗提獲得植物多糖，再對植物多糖經酸或堿等化學降解方法處理來獲得寡糖。其中的化學降解方法對儀器的腐蝕性大，且污染環境。并且現在研究比較全面的是褐藻寡糖和紅藻寡糖，而綠藻寡糖的研究則未見報道，綠藻被人類認識和利用的程度也遠不如褐藻和紅藻。
另外，現有的綠藻多糖提取工藝中，綠藻多糖粗提液可經超濾膜過濾對多糖進行純化，但是，由于活性多糖成分基本都被截留（即大部分的活性多糖都存留于超濾后的濾渣中），而超濾后的濾液的成分通常被認為是沒有利用價值的物質，因此，超濾后的濾液都是被作為“廢液”直接排入污水系統。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種利用提取多糖后的綠藻廢液提取寡糖的工藝。
一種利用提取多糖后的綠藻廢液提取寡糖的工藝，包括以下步驟：
（1）收集提取多糖后的綠藻廢液；
（2）采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾，收集濾液；
（3）在50~100 rpm的攪拌速度下，向濾液中投入殼聚糖絮凝劑進行絮凝分離，絮凝劑的投入量為300~500 ppm，攪拌2~4h，離心，收集絮凝分離物；
（4）對絮凝分離物進行冷凍干燥，獲得分子量為2000Da以下綠藻寡糖的粉末。
本發明的技術方案是本申請人多次克服技術局限和技術偏見的基礎上才獲得的，具體為：
（1）由于現有的植物寡糖提取工藝為：以植物體的莖、葉等為原材料，經粗提獲得植物多糖，再對植物多糖經酸或堿等化學降解方法處理來獲得寡糖，本領域技術人員通常會采用綠藻粗多糖作為原材料來提取寡糖，而不會想到采用提取多糖后的廢液來提取寡糖，并且，現有的綠藻多糖提取工藝中，本領域技術人員通常認為：提取多糖的綠藻廢液中的成分為沒有利用價值的物質，因此，提取多糖的綠藻廢液都是被作為“廢液”直接污水系統，但是，本發明人克服這些技術局限，采用提取多糖后的綠藻廢液作為原材料，從中提取寡糖，實現了資源的合理利用，節約了成本；
（2）根據現有技術中所公布的“海藻寡糖的分子量通常為2000-8000Da”，本領域普通技術人員通常認為：截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾液的主要成份是蛋白質、礦物質、鹽分等小分子成分，其不含有寡糖成分，因此，截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾液通常也是被作為“廢液”直接廢棄處理的。而本申請人克服本領域的技術偏見，對分子量為2000Da以下的綠藻寡糖進行純化收集，其原因在于：在對截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣進行抗菌活性測試時，本申請人誤將截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾液當作截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣稀釋液來用，卻獲得了意想不到的發現：濾液對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌均有顯著的抑制生長作用，其中對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最為顯著，并且，雖然截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾液中寡糖的得率均為15%左右，遠遠低于截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣中寡糖的得率85%左右，但是，截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾液對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用卻遠遠高于截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣。這就說明：分子量為2000Da以下的綠藻寡糖粉末中含有某種特殊的寡糖成分，其對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌作用，這為進一步對分子量為2000Da以下的綠藻寡糖粉末中的活性寡糖成分進行提純和研究提供了線索；
（3）與現有技術中絮凝分離步驟中攪拌速度為300~500rpm相比，本發明突破了技術局限，采用了攪拌速度—50~100rpm來進行綠藻寡糖的絮凝分離，大大提高了寡糖得率，并且，本領域技術人員通常認為：過低的攪拌速度不利于小分子寡糖實現有效絮凝，本發明采用50~100rpm的攪拌速度克服了一定的技術偏見，另外，本申請人還進一步克服現有技術局限，采用絮凝時間為2~4h（現有技術中絮凝分離中絮凝時間為5~40min）的技術特征，進一步提高了寡糖得率，獲得了意想不到的技術效果。
本發明通過利用提取多糖后的綠藻廢液來提取寡糖，大大節約了成本，同時，獲得了分子量為2000Da以下的綠藻寡糖粉末，該綠藻寡糖粉末顯示出了絕佳的抑制嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌兩種水產致病菌的活性功能，并且，該寡糖的得率也較高。
所述的綠藻廢液通過以下步驟獲取：綠藻干粉→加水提取→粗濾→離心→超濾膜過濾；其中，在加水提取步驟中，水與綠藻干粉的初始質量比為40 ～ 60 ：1，采用超聲波法協同酶法進行綠藻多糖的提取；在超濾膜過濾步驟中，采用截留分子量為5000Da的濾膜對離心后的上清液進行過濾，收集濾液，即為綠藻廢液。本發明人采用超聲波法協同酶法進行綠藻多糖的提取，綠藻廢液中多糖的得率最高，且超聲波法和酶法均具有操作簡單、反應迅速、無環境污染等優勢；另外，酶法提取主要起到水解破壞細胞壁的作用，加上，超聲波雖然能使綠藻多糖產生一定程度的降解，從而使綠藻水溶液的粘度顯著降低，但是，其降解后的產物依然為多糖成分，而不是分子量較小的寡糖成分，因此，采用酶法和超聲波法提取寡糖利于得到天然的寡糖成分，同時，綠藻水溶液的粘度變小，有利于膜過濾純化的進行，進一步節約成本。進一步的，酶法提取中的酶優選采用纖維素酶，容易獲得、成本低。所述的截留分子量為5000Da的濾膜后的濾渣用于提取綠藻多糖，最大程度的實現綠藻的資源化利用，避免浪費。
所述的截留分子量為2000Da的濾膜過濾后的濾渣用于提取分子量為2000-5000Da的綠藻寡糖，最大程度的實現綠藻的資源化利用，避免浪費。
所述的綠藻優選采用石莼、滸苔兩種綠藻中的任一種或組合。石莼、滸苔均廣泛分布在東南沿海的潮間帶，容易獲取，并且，與海帶等褐藻相比，其水溶液的粘度更低，有利于膜過濾純化的進行，最大程度的節約成本。
所述的采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾的具體步驟的為：在真空抽濾瓶內放入截留量為2000 Da的濾膜，將提取多糖后的綠藻廢液倒入真空抽濾瓶內，抽濾至真空抽濾瓶內的液面為50 ml時，向真空抽濾瓶內加入無離子水稀釋5~10倍輕輕攪拌后再抽濾，再抽濾至完全后，收集濾液，可盡量多的收集到分子量為2000Da以下的綠藻寡糖。
具體實施方式
現具體闡述本發明的較佳實施方式：
一種利用提取多糖后的綠藻廢液提取寡糖的工藝，包括以下步驟：
（1）收集提取多糖后的綠藻廢液；
（2）采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾，收集濾液，其中，所述的采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾的具體步驟的為：在真空抽濾瓶內放入截留量為2000 Da的濾膜，將提取多糖后的綠藻廢液倒入真空抽濾瓶內，抽濾至真空抽濾瓶內的液面為50 ml時，向真空抽濾瓶內加入無離子水稀釋5~10倍輕輕攪拌后再抽濾，再抽濾至完全后，收集濾液；
（3）在50~100 rpm的攪拌速度下，向濾液中投入殼聚糖絮凝劑進行絮凝分離，絮凝劑的投入量為300~500 ppm，攪拌2~4h，離心，收集絮凝分離物；
（4）對絮凝分離物進行冷凍干燥，獲得分子量為2000Da以下綠藻寡糖的粉末；
其中，所述的綠藻廢液通過以下步驟獲取：綠藻干粉→加水提取→粗濾→離心→超濾膜過濾；在加水提取步驟中，水與綠藻干粉的初始質量比為40 ～ 60 ：1；在超濾膜過濾步驟中，采用截留分子量為5000Da的濾膜對離心后的上清液進行過濾，收集濾液，即為綠藻廢液。
本申請人根據上述技術方案進行了8項實施例（即實施例1~8），同時，為了體現本發明的多糖提取方法和絮凝分離步驟中攪拌速度、絮凝劑投入量、絮凝時間對綠藻廢液中寡糖得率和分子量小于2000Da的綠藻寡糖得率的影響，本發明還提供了9項對比例（即對比例1~9），并采用蒽酮- 硫酸比色法分別測定綠藻廢液中寡糖得率、經截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣與濾液中寡糖的比例和以綠藻多糖廢液中綠藻寡糖含量為100%計，最終獲得的分子量為2000Da以下的寡糖粉末中綠藻寡糖的得率。其中，實施例1~8和對比例1~9的不同之處列舉如下表1：
實施例1~8和對比例1~9的試驗數據列舉如下表2：
從表1和表2中實施例1~8的試驗數據可看出，與單純的采用超聲波和單純的采用酶法提取多糖相比，采用超聲波協同酶法提取多糖時，綠藻廢液中寡糖的得率最高。將表1和表2中實施例1~8與對比例1~9的實驗數據進行對比可看出，絮凝分離步驟的攪拌速度限定為50~100 rpm、攪拌時間限定為2~4h，可大大提高了分子量為2000Da以下綠藻寡糖的得率，同時，絮凝劑的投入量限定為300~500 ppm，又進一步提高了分子量為2000Da以下綠藻寡糖的得率，使得分子量為2000Da以下綠藻寡糖的得率最高可達到14.41%。同時，本發明的實施例1~8均通過利用提取多糖后的綠藻廢液來提取寡糖，大大節約了成本。
另外，本申請人分別將實施例4、實施例5、實施例6中經截留量為2000Da濾膜過濾后的濾渣溶解液（即分子量為2000~5000Da的綠藻寡糖）、實施例4、實施例5、實施例6中經截留量為2000Da濾膜過濾后的濾液（即分子量為2000Da以下的綠藻寡糖）分別稀釋為寡糖濃度為4g/L的寡糖溶液，并分別加入嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌三種常見水產致病菌的發酵液中進行培養，培養15h，待全部培養結束后，以空白的培養基為對照，測定600 nm處的光密度值（即OD600值），結果如下表3：
從表3可看出，本發明的實施例4、實施例5、實施例6所獲得的截留量為2000Da濾膜過濾后的濾液對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌這三種常見水產致病菌均存在明顯的（即分子量為2000Da以下的綠藻寡糖）抑制作用，并且，其對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最為顯著，其抑制作用遠遠優于截留量為2000Da濾膜過濾后的濾渣對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用。另外，從表3中也可看出，與采用小球藻作為原材料（即實施例5）相比，采用滸苔、石莼作為原材料（即實施例4、實施例6）獲得的截留量為2000Da濾膜過濾后的濾液對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌這三種常見水產致病菌的抑菌效果均更佳。
當然，本發明的原材料也并不限于實施例1~8中的滸苔和石莼，也可以是其他常見的綠藻，但是，石莼、滸苔均廣泛分布在東南沿海的潮間帶，更容易大量獲取，且采用石莼、滸苔作為原材料根據本發明的技術方案獲得的截留量為2000Da濾膜過濾后的濾液對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌這三種常見水產致病菌的抑菌效果最佳。另外，雖然，本發明僅提供了滸苔、石莼這兩種綠藻單獨作為原材料的實施例，但是，實際上，本發明也可以采用這兩種綠藻組合作為原材料來提取綠藻寡糖。
另外，本發明的步驟（2）中采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾的具體步驟不限于實施例1~8的具體操作，也可以是：在真空抽濾瓶內放入截留量為2000 Da的濾膜，將提取多糖后的綠藻廢液倒入真空抽濾瓶內，直接抽濾至完全后，收集濾液。但是，同等條件下，將實施例4步驟（2）中采用截留分子量為2000 Da的濾膜對提取多糖后的綠藻廢液進行膜過濾的具體步驟替換為上述步驟后，所獲得的經截留量為2000 Da濾膜過濾后的濾渣與濾液中寡糖的比例為86：14，同時，以綠藻多糖廢液中綠藻寡糖含量為100%計，分子量為2000Da以下綠藻寡糖的得率僅為13.54%。
本發明的實施例1~8均可做如下改進：
（1）所述的截留分子量為5000Da的濾膜后的濾渣用于提取綠藻多糖，最大程度的實現綠藻的資源化利用，避免浪費。
（2）所述的截留分子量為2000Da的濾膜過濾后的濾渣用于提取分子量為2000-5000Da的綠藻寡糖，最大程度的實現綠藻的資源化利用，避免浪費。
本發明的實施例1~6和實施例8還可做如下改進：酶法提取中的酶優選采用纖維素酶，容易獲得，且成本低。