一種新型檢測H2S熒光分子探針的制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種新型檢測H₂S熒光分子探針的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在過去幾年中，對于硫化氫的生理功能的不斷研究，硫化氫被看作是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種信號分子，據(jù)報道，在人體血液中內(nèi)源性的硫化氫含量是10-100 μM，內(nèi)源性的硫化氫可以參與很多方面的生理過程，例如舒緩血管平滑肌，調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞，抑制胰島素信號，調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥以及氧氣釋放等?？紤]到硫化氫具有很高的擴散性和活性，從而導(dǎo)致硫化氫在生理條件下主要以硫氫根離子（SH^-）形式存在。

硫化氫的內(nèi)源水平與一些疾病如阿爾茨海默氏病，唐氏綜合征，糖尿病和肝硬化，此外，它已被證實為有毒氣體；熒光檢測方法具有簡單，高靈敏度，低成本和能實時性檢測等特點。因此，發(fā)展在溫和條件下對硫化氫具有快速反應(yīng)的高選擇性和靈敏性的熒光探針尤為重要，因為它們對于更好和更深入地了解硫化氫的生物學(xué)功能具有很大的幫助。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于克服一些現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種選擇性好，靈敏度高，響應(yīng)速度快，新型檢測H₂S熒光分子探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種制備方法簡單、反應(yīng)條件溫和、成本較低的上述熒光分子探針的合成方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為，一種新型檢測H₂S熒光分子探針，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)如（1）所示。

本發(fā)明使用的新型檢測H₂S熒光分子探針，采用E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯在縛酸劑的存在下發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成的碳氧鍵作為檢測基團(tuán)。

一種新型檢測H₂S熒光分子探針的制備方法，所述的熒光分子探針的制備方法包括以下步驟：

. 將E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯溶于無水乙腈中，加入當(dāng)量的無水三乙胺，100℃下攪拌回流反應(yīng)24小時;

. 將步驟中的反應(yīng)液冷至室溫，過濾，真空干燥濾餅得到所述熒光分子探針化合物。

所述的步驟中的E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯摩爾比為1:1.1-1 :1.5。

所述的熒光分子探針在細(xì)胞內(nèi)成像的應(yīng)用。

在本說明書的實施例中更詳細(xì)地說明了該探針的合成和檢測方法。

本發(fā)明的熒光分子探針使用方法沒有特殊限制，通?？梢栽谑覝叵聦⑻结樂肿尤芙庠诙谆鶃嗧浚―MSO）和水溶液（2:8，v/v）中進(jìn)行測試。

本發(fā)明的一種新型檢測H₂S熒光分子探針的具體特征如下：

該分子熒光探針用二甲基亞砜（DMSO）溶解，探針分子在二甲基亞砜（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時其最大紫外吸收波長在320 nm。 加入硫氫根離子后，探針分子產(chǎn)生一個以475 nm為中心的新的寬吸收峰，隨著硫氫根離子濃度的增高，吸收峰逐漸上升，同時在320 nm處的吸收峰的逐漸下降。相應(yīng)地，溶液的顏色由紅色變?yōu)闊o色，裸眼能夠清楚的看到顏色的明顯變化。而且，探針分子在二甲基亞砜（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時基本無熒光，當(dāng)加入硫氫化鈉（常用的H₂S供體）后，探針分子有一明顯的熒光發(fā)射光譜，最大發(fā)射波長在620 nm，接近近紅外區(qū)域，非常有利于生物細(xì)胞成像分析。

本發(fā)明所述的熒光探針分子靈敏度高，熒光性能穩(wěn)定，合成步驟簡單，產(chǎn)率高，選擇性好，檢測速度快較其他方法快，檢測限低等優(yōu)點，并且適合裸眼檢測，同時，該分子熒光探針不受SO₃^2-, NO₃^-, NO₂^-, SCN^-, CN^-, SO₄^2-, HSO₄^-, HSO₃^-, S₂O₃^2-, S₂O₈^2-等陰離子的干擾，即使在有干擾離子存在的條件下，探針也對H₂S有很好的響應(yīng)，使得該熒光分子探針在生物化學(xué)，環(huán)境保護(hù)科學(xué)等分析檢測領(lǐng)域用于H₂S的檢測，具有潛在的實際應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的熒光探針在二甲基亞砜和水溶液（2:8，v/v）體系中，紫外吸收光譜隨加入H₂S濃度增加的變化情況，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為吸光度。

圖2為本發(fā)明的熒光探針在二甲基亞砜和水溶液（2:8，v/v）體系中，熒光發(fā)射光譜隨加入H₂S濃度增加的變化情況，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為歸一化熒光強度。

圖3為本發(fā)明的熒光探針在二甲基亞砜和水溶液（2:8，v/v）體系中，熒光發(fā)射光譜隨加入等濃度不同離子變化情況，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強度（圖中ygx15為該探針的代號）。

圖4為本發(fā)明的熒光探針的核磁共振氫譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

本發(fā)明所述的熒光分子探針的合成路線如下圖所示。

實施例1

步驟1. 合成2-（苯并[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚

a. 將3 g 2-羥基-3-甲基苯甲酸和2.25 g 鄰氨基苯酚及40 mL多聚磷酸加入100 mL圓底燒瓶中，在120℃下攪拌反應(yīng)6小時，然后在160℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)5小時；

b. 將步驟a中的反應(yīng)液冷卻至室溫，然后倒入冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，過濾，真空干燥即得2-（苯并[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚。

步驟2. 合成3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯甲醛

. 將2 g 2-（苯并[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚和5.8 g烏洛托品溶于50 mL三氟乙酸中，在攪拌回流狀態(tài)下反應(yīng)8小時；

. 將步驟中的反應(yīng)液冷卻至室溫，加水稀釋，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥；

. 將步驟中的反應(yīng)液加水并攪拌回流1小時，5℃過夜，過濾，水洗固體，干燥得得目標(biāo)化合物。

步驟3. 合成E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物

①. 將1 g 3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯甲醛和0.88 g 1,4-二甲基吡啶-1-鎓碘化物溶于15 mL無水乙醇，加入6-7滴哌啶，室溫反應(yīng)12小時；

②. 將①中的反應(yīng)液過濾，無水乙醇洗滌所得固體，真空干燥得E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物。

步驟4. 合成E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-（2,4-二硝基苯氧基）-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物

.將1.5 g E-4-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和0.631 g 2,4-二硝基氟苯溶于15 mL無水乙腈中，加入394 mg的三乙胺，100 ℃下攪拌回流反應(yīng)24小時；

. 將步驟中的反應(yīng)液冷至室溫，過濾，真空干燥濾餅得到所述熒光分子探針化合物1.608 g。

上述熒光分子探針的核磁氫譜數(shù)據(jù)：¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.02 – 8.97 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.97 – 8.91 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 8.63 – 8.58 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.35 – 8.28 (m, 3H), 8.25 – 8.19 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 8.13 – 8.07 (m, 2H), 8.03 – 7.98 (m, 1H), 7.75 – 7.67 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.59 – 7.53 (m, 1H), 7.50 – 7.44 (m, 1H), 7.06 – 7.01 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 4.34 – 4.27 (s, 3H), 2.30 – 2.22 (s, 3H)。

實施例2：新型檢測H₂S熒光分子探針的應(yīng)用

將該分子熒光探針溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配置成1 mmol/L的探針溶液；取探針溶液加入相應(yīng)的二甲基亞砜（DMSO）和PBS（pH=7.4）緩沖液，配置成10 μM（有機相：PBS水相=2:8，v/v）的溶液，測試其紫外吸收光譜變化情況。圖1表明探針分子在二甲基亞砜（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時其最大紫外吸收波長在320 nm，隨著加入H₂S濃度的增加，其紫外吸收光譜明顯發(fā)生變化，探針分子產(chǎn)生一個以475 nm為中心的新的寬吸收峰，隨著硫氫根離子濃度的增高，吸收峰逐漸上升，同時在320 nm處的吸收峰的逐漸下降。相應(yīng)地，溶液的顏色由紅色變?yōu)闊o色，裸眼能夠清楚的看到顏色的明顯變化。

將該分子熒光探針溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配置成1 mmol/L的探針溶液；取探針溶液加入相應(yīng)的二甲基亞砜（DMSO）和PBS（pH=7.4）緩沖液，配置成10 μM（有機相：PBS水相=2:8，v/v）的溶液，測試其熒光發(fā)射光譜變化情況，圖4表明，探針分子在二甲基亞砜（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時基本無熒光，當(dāng)加入硫氫化鈉后，探針分子有一明顯的熒光發(fā)射光譜，最大發(fā)射波長在620 nm，接近近紅外區(qū)域，非常有利于生物細(xì)胞成像分析。同時，該分子熒光探針不受SO₃^2-, NO₃^-, NO₂^-, SCN^-, CN^-, SO₄^2-, HSO₄^-, HSO₃^-, S₂O₃^2-, S₂O₈^2-等陰離子的干擾，即使在有干擾離子存在的條件下，探針也對H₂S有很好的響應(yīng)，使得該熒光分子探針在生物化學(xué)，環(huán)境保護(hù)科學(xué)等分析檢測領(lǐng)域能用于H₂S的檢測，具有潛在的實際應(yīng)用價值。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實施例作了詳細(xì)的介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍因由所附的權(quán)利要求來限定。