與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP標記的應用的制作方法

本發明涉及一個與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP標記的應用。

背景技術：

桃[Prunus persica(L.)Batsch]是深受消費者歡迎的水果之一。據聯合國糧農組織數據，2013年我國桃栽培面積1166萬畝，占世界栽培總面積的50.5％，是我國栽培面積較大的落葉果樹之一。

我國是桃起源中心，具有豐富的遺傳資源。作為重要的農藝性狀之一，樹型種類多樣，包括普通生長型(Standard type)、柱型(Pillar type)、半矮生型(Semi-dwarf type)、垂枝型(Weeping type)、直立型(Upright type)、短枝型(Spur type)和矮化型(Dwarf type)等幾類(Bassi et al.,1994)。確定不同生長型樹體結構的遺傳特征是開展后續研究的關鍵；也是建立目標性狀的分子輔助選種體系和進行品種遺傳改良的前提，具有十分重要的科學和產業意義。近年來隨著生物技術的進步，特別是基于二代測序的標記技術加速了作物基因的精細定位和分子輔助選種體系的建立(Takagi et al.2013；Abe et al.2012)。

矮化型桃有多種類型，由于樹體矮小，是盆栽觀賞的重要育種資源，定位控制桃矮化基因并獲得相關的分子標記是建立分子輔助選種體系并創制新的矮化觀賞桃品種的前提。基于此本發明對桃矮化基因進行了定位，并得到了緊密連鎖的SNP標記，可實現對目標性狀進行分子鑒定，確立目標性狀的分子輔助選種體系。

技術實現要素：

解決的技術問題：本發明針對以上情況，提供一種與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP標記的應用。

技術方案：與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP分子標記在桃樹育種中的應用，所述分子標記分別位于桃基因組(Version 2.0)Scaffold 6上28.1Mb和29.2Mb處，為SNP260k-2和SNP260k-13，其中SNP260k-2的等位基因為C和T，序列如SEQ ID NO.1所示：TTTCTTCCTGGAAAACACGTTGAGCTTTTATTGCAGTTAAATCGTACATATTGCAGTTTGCAGTGGCCTGAATTACTGTAGTAACATACTCTTAAAGTAGAAGTGAAAAATTGTCTTACTGGCAGTAGATTCTATGCTGAGAAAATTCTCAGCTAGATGAAAATGTTGAAGGTAAATTAGATAAGGAAAAGCATACAAGTTCCACCGGATAAAGAACTCAACTGGATATAATACATGGCAGTGGATTATAAATACAAGGGCCAACTTAAGAGGGACTAAAAGTGCTAAAAATCAGACACCAACTCATCAACCAAAGAATTTAGTATCTCCTTCTCAATCTCTAGACCCTCCTCAAATGTTTCAATGTCGAAGTCAAGCCATCTCCCATGA，SNP260k-13的等位基因為G和A，位點側翼序列如SEQ ID NO.2所示：GTATTTTTTGAATAGACATAAGCATTATCATCTATAGAAAATAGAATTTATTCTCAGGCAGGAAATAAAAACTTCAAATAAAAGCAAGGAGAACTACGTTGAAAATAAGTAAGTTACTTGGTGTTTTCTCTAGGGGGTAGGCGATTATTCAACACGCAATCGAGACACCACCAAGA。下劃線表示等位基因位點。

上述矮化型桃樹SNP260k-2位點基因型為T，SNP260k-13位點基因型為A。

檢測與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP分子標記的引物對：

SNP260k-2：5-AGGGTTTCATGGCGTTAAAGC-3；

5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3；

SNP260k-13：5-CTTTTCTCCGCCGCGTTAAT-3；

5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3；

檢測雜交后代單株的引物對：

YZ-dw-SNP(F/R)：5-CTCTGCTTCTTCTGTTTGTGGT-3；

5-ACATCTAGCCGGCCAGTG-3；

一種檢測矮化桃樹的試劑盒，含有SNP260k-2和SNP260k-13引物對。

上述檢測矮化桃樹的試劑盒，還含有YZ-dw-SNP(F/R)引物對。

與桃矮化基因緊密連鎖的SNP標記，所獲得的SNP標記引物為DwSNP-2F和DwSNP-13F，分別位于桃基因組(Version 2.0)Scaffold 6上28.1和29.2Mb處，主要采用如下方法得到：

(1)花期前將05-2-144單株人工套布袋自交，果實成熟后破核取種子，將種子進行包衣(包衣劑，先正達)，晾干后，放于濕潤的粗砂中置冷庫中層積處理，次年1月取出萌發的種子，種植于穴盤中用于表型觀察。

(2)對05-2-144單株后代實生苗株高進行目測觀察，區分普通型和矮化型幼苗分開定植，繼續鑒定表型以確定分離比例；

(3)參考桃基因組(Genome Database for Rosaceae數據庫)序列，采用primer3Web Version 4.0(http://primer3.ut.ee/)在Scaffold 1到8上設計引物，引物退火溫度在60℃左右，長度20-23bp，約每1Mb設計1對引物，擴增片段長度為約1600bp或750bp，用于開發基于Sanger測序的SNP標記；

(4)基因組DNA的提取采用CTAB法，略作修改；

(5)基于Sanger測序法獲得SNP標記，并根據子代基因型和表型確定候選SNP標記，并在雜交群體后代單株中進行序列測定，進行初步定位；

(6)在初步定位區間內，對親本進行深度測序，根據基因型和表型開發更多的Aa基因型的SNP標記，后擴大分離群體，開發緊密連鎖的SNP標記，并在其他雜交群體(10-7*96-5-1)后代單株中進行驗證，以建立目標性狀的分子輔助選種體系。

有益效果：本發明采用基于Sanger技術開發的第三代SNP的標記技術，以構建的雜交分離群體為研究材料，采用圖位克隆的方法，初步定位目標基因。基于二代測序技術在精細定為區域內，開發更多的基因型和表型一致的SNP標記，繼續精細定位以獲得與目標性狀緊密連鎖的標記。由于研究的對象為桃矮化性狀，可依據獲得的緊密連鎖標記在含有矮化基因的普通生長型桃中進行早期鑒定，篩選親本并應用于矮化觀賞桃育種，建立矮化性狀的分子標記輔助選種體系。

附圖說明

圖1普通型桃植株表型圖；

圖2矮化型桃植株表型圖；

圖3 DNA瓊脂糖電泳圖(M1為DL 5000 DNA marker；M2為DL 15000 DNA marker，1-9為部分提取DNA樣品)；

圖4基于二代測序Aa基因型的SNP標記示意圖；

圖5與目標性狀緊密連鎖的SNP標記SNP260k-2的測序峰圖和SNP位點；

圖6與目標性狀緊密連鎖的SNP標記SNP260k-13的測序峰圖和SNP位點。

具體實施方式

實施例1

(一)、表型的鑒定

將05-2-144自交后代桃核經自然干燥后用錘子將外殼敲開，取種子進行包衣(包衣劑，先正達)，晾干后，放于濕潤的粗砂中進行層積處理，次年1月取出萌發的種子，種植于穴盤中用于表型觀察。

(二)、雜交群體分離比例的鑒定

通過對萌發后種子幼苗觀察，共得到293株自交后代單株，其中普通型222株，矮化型71株，二者比例接近3:1，P值為0.761，符合孟德爾遺傳規律，矮化性狀為隱性單基因控制。同時我們對定植后植株表型進行了再鑒定，二者觀察結果一致。

(三)、基因組DNA的提取，SNP標記的開發

(1)基因組DNA的提取

采用CTAB法提取桃葉片基因組DNA，略作修改，具體如下：(1)取新鮮的葉子，放入1.2ml96孔板中，加入鋼珠和液N₂，在磨樣機中進行碾磨，直至碾磨細粉狀為止；(2)加入配制好的CTAB液400μL，進行1h長的65℃水浴，其間約每10min輕搖勻；(3)加入氯仿和異戊醇混合液，體積比為24：1，直至2ml的離心管滿載線，后緩慢(防止剪裂)顛倒混勻10分鐘。放入冷凍離心機(Eppendorf 5810R)4℃條件下，4000rpm，離心10分鐘；(4)吸取上清液，轉入200μL的96孔PCR板，加入等體積的預冷無水乙醇(混勻),于-20℃冰箱1小時；(5)將上述1.5ml離心管放入冷凍離心機(Eppendorf 5810R)，4℃條件下，4000rpm,離心10分鐘，棄上清液；(6)在帶有沉淀的96孔PCR板中加入200μL的70％的乙醇，1000rpm瞬時離心，洗滌沉淀2次，加入無水乙醇洗滌沉淀一次，后自然晾干；(7)在室溫下自然風干沉淀后，加入200μL體積的0.1×TE溶解沉淀DNA，同時加入0.5μL的RNase，37℃放置1h，祛除RNA污染(長期保存在-20℃冰箱,常用則存于4℃冰箱)；(8)采用NanoDrop 1000 spectrophotometer(Themo)和1％的瓊脂糖膠對提取的DNA的純度濃度和完整度進行檢測，并稀釋成工作液濃度(25ng/μL)，以用于后續研究。

(2)基于Sanger測序SNP開發的引物設計

參考桃基因組序列(Genome Database for Rosaceae數據庫)，采用primer3Web Version 4.0(http://primer3.ut.ee/)設計引物，引物退火溫度在60℃左右，引物長度20-23bp，開發基于Sanger測序的SNP標記，選擇每1Mb設計1對引物，擴增片段長度約為1600bp或750bp。

(3)PCR反應體系以及SNP標記的獲得

PCR擴增體系總體積為40μL，具體組分如下：

混勻后，在離心機(5810R，Eppendorf)離心，并在PCR儀(Eppendorf)上進行擴增。PCR擴增程序為95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃70s，34個循環；72℃10min。

對父母本、后代各兩個單株進行PCR擴增，PCR產物送上海生工進行序列測定，根據測定序列信息在Contig軟件中打開，序列對齊后尋找多態性SNP標記。

(4)基于二代測序SNP標記的開發

構建好文庫后對親本05-2-144進行深度測序，在儀器HiSeq 4000(Illumina，CA)上進行，測序深度約為60X。在定位區域內采用Integrative Genomics Viewer 2.3(IGV)對Bam格式數據進行分析，確定目標區域內基因型為Aa的SNP，以確定候選標記，用于連鎖SNP標記的開發。

(四)、目標性狀緊密連鎖標記的開發與目標性狀的定位

根據表型鑒定結果，我們在矮化和普通型各兩個子代和親本中尋找連鎖的SNP標記，具體基因型表現為，自交親本05-2-144基因型為Aa，矮化型子代基因型為aa，普通型子代基因型為AA和Aa，在4個子代中獲得連鎖的SNP標記后，擴大至分離后代各20個單株中，確定連鎖后進一步擴大至全部樣品中，完成初步定位。同時結合親本二代測序結果開發的SNP標記，在群體所有后代單株中進行SNP分析，確定交換單株獲得緊密連鎖的SNP標記。

(五)、基于分子標記的植株表型鑒定

根據已經獲得的緊密連鎖的SNP標記的物理位置，參考桃基因組數據在新的親本(10-7*96-5-1)中開發基因型和表型一致的SNP標記(YZ-dw-SNP F/R)。即在同一位點，雙親基因型均為Aa，目的是利用分子標記對雜交后代單株的表型進行鑒定。通過標記基因型和表型比較，顯示驗證符合率為100％。

表1本發明所采用緊密連鎖SNP標記的引物信息

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農業科學院鄭州果樹研究所

<120> 與桃樹矮化基因緊密連鎖的SNP標記的應用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttcttcctg gaaaacacgt tgagctttta ttgcagttaa atcgtacata ttgcagtttg 60

cagtggcctg aattactgta gtaacatact cttaaagtag aagtgaaaaa ttgtcttact 120

ggcagtagat tctatgctga gaaaattctc agctagatga aaatgttgaa ggtaaattag 180

ataaggaaaa gcatacaagt tccaccggat aaagaactca actggatata atacatggca 240

gtggattata aatacaaggg ccaacttaag agggactaaa agtgctaaaa atcagacacc 300

aactcatcaa ccaaagaatt tagtatctcc ttctcaatct ctagaccctc ctcaaatgtt 360

tcaatgtcga agtcaagcca tctcccatga 390

<210> 2

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtattttttg aatagacata agcattatca tctatagaaa atagaattta ttctcaggca 60

ggaaataaaa acttcaaata aaagcaagga gaactacgtt gaaaataagt aagttacttg 120

gtgttttctc tagggggtag gcgattattc aacacgcaat cgagacacca ccaaga 176

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggtttcat ggcgttaaag c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaactgaact gctcttccac gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttttctccg ccgcgttaat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccgggatgt gacaatttgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctctgcttct tctgtttgtg gt 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acatctagcc ggccagtg 18