本發明涉及微生物技術領域的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑。
背景技術：
金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一，廣泛分布于自然界，是一種可以引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。目前在食品、化妝品衛生標準中已將金黃色葡萄球菌的檢驗作為常規檢驗項目。
金黃色葡萄球菌多以凍干粉的形式供應市場，國內外廣泛采用的金黃色葡萄球菌凍干保護劑有可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、乳糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、維生素C等。據文獻報道，以脫脂奶粉為單一保護劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率不足50%，而以可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、磷酸鹽緩沖液作為菌種復方冷凍干燥保護劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率也只有51.74%。這些保護劑的保護效果都不夠理想，而實際上，凍干保護劑的作用會隨保護劑的組成和配比表現出一定的差異性，因此，開發性質獨特、作用高效的金黃色葡萄球菌凍干保護劑具有重要意義。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種能有效提高金黃色葡萄球菌凍干制備過程存活率的新型復合保護劑。
本發明通過以下技術方案實現：
一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑，包括海藻糖、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽和牛血清白蛋白。
一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑，以質量體積百分比計，包括以下組分：
海藻糖2%-6%、谷氨酸鈉12%-18%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%-1.5%、牛血清白蛋白0.25%-0.75%。
所述的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑，優選，以質量體積百分比計，包括以下組分：
海藻糖2%、谷氨酸鈉15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、牛血清白蛋白0.5%。
本發明中涉及到的百分號“%”，若未特別說明，均指質量體積百分比；溶液的百分比，除另有規定外，均指溶液100ml中含有溶質若干克。
若未特別說明，本發明中涉及到的溶液的溶劑均為水。
本發明的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的有益效果如下：
復合保護劑中加入海藻糖可以替代細胞中的水分子與細胞膜和蛋白質上的親水基團形成水合鍵，保證了蛋白質結構和功能的穩定，同時海藻糖還可以提高菌懸液的玻璃化轉變溫度，使菌懸液形成玻璃態，使敏感性物質嵌入到玻璃態中，從而保護細胞；谷氨酸鈉在凍干過程中可以與水作用使干粉保留微量的水分，以滿足微生物細胞維持生命的最低需求，此外谷氨酸鈉還具有抗氧化的作用，抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止對細胞膜造成不可逆的破壞；L-半胱氨酸是唯一具有活性巰基（-SH）的氨基酸，具有還原性，在凍干過程中，氨基酸的氨基團與微生物細胞蛋白質的羰基作用，可以使蛋白質的結構穩定；血清白蛋白是一種經典、優良的蛋白質穩定劑，可以使蛋白質活性不受損失，對凍干過程中的大多數蛋白都具有保護作用。
綜上，本發明提供的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑，結合糖類、蛋白類保護劑和抗氧化劑，使其達到增效、協同的作用，有效提高了金黃色葡萄球菌凍干粉的存活率，可以達到99.82%。
具體實施方式
以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不脫離本發明技術方案的精神和實質的前提下，凡是對本發明技術方案進行的修飾或者替換，均應涵蓋在本發明的保護范疇中。
實施例中涉及到的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標準菌株（CICC 21600）由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。
在實施例中，菌粉的制備及凍干存活率的計算采用如下方式：在常規的適宜條件下轉接復活菌株后搖瓶擴增，將穩定初期菌懸液6000rpm離心10min，棄上清，留菌泥用等量生理鹽水洗滌，6000rpm離心10min，棄上清，將得到的菌泥與保護劑混勻，取1ml按10倍遞增稀釋法稀釋，選擇適宜稀釋度傾注法計數，其余菌液分裝西林瓶， -80℃預凍2-3h，然后真空冷凍干燥16-18h，壓蓋，下機，-20℃保藏。結束干燥后，隨機取3瓶立即復水，用1.1ml生理鹽水使其溶解完全，取1ml按前述方法計數，計算凍干前后的活菌數之比，即保護劑對于菌種的凍干存活率。
實施例1
本實施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調整水的總質量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌復合凍干保護劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養、離心、洗滌后，收集菌泥，在凍干前與保護劑混合，分裝，于-80℃預凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為94.10%。
實施例2
本實施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的組成為：海藻糖4g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加4g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調整水的總質量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護劑混合，分裝，于-80℃預凍3h，然后冷凍干燥16h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為71.40%。
實施例3
本實施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉18g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、18g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調整水的總質量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護劑混合，分裝，于-80℃預凍3h，然后冷凍干燥17h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為77.88%。
實施例4
本實施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.5g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調整水的總質量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護劑混合，分裝，于-80℃預凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為99.82%。
實施例5
本實施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復合保護劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。
其制備方法：
1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；
2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過濾除菌；
3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調整水的總質量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護劑。
將金黃色葡萄球菌活化培養、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護劑混合，分裝，于-80℃預凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經檢測金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為93.87%。