本發明屬于多肽產品合成制備的技術領域，特別涉及一種磷酸化多肽的固相合成方法。
背景技術：
磷酸化多肽序列：TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC，分子量：2288.08。
磷酸化修飾是一種重要的蛋白質化學修飾，對蛋白質功能的完成或改變起到重要作用。生命活動與蛋白質的動態變化密切相關，很多情況下某些蛋白質的絕對量并不會發生明顯變化，而是通過各種翻譯后完成或改變其功能。在眾多的蛋白質翻譯后修飾中，磷酸化修飾時非常重要的一種，現今發現的所有蛋白質中超過30％可被磷酸化修飾。然而異常的磷酸化也是引起諸多疾病的起因，尤其是突變的蛋白激酶、磷酸酶可導致許多紊亂，很多天然毒素和病原體也是通過改變胞內蛋白的磷酸化狀態來發揮它們的影響。絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化作用是一個可逆的蛋白修飾過程，它們參與調節無數的細胞活動，如受體信號轉導、蛋白質締合與分割、激活或抑制蛋白功能，甚至細胞的存活等。許多激素均是通過提高絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基的磷酸化狀態來調節特異性酶的活性。
傳統合成磷酸化多肽時需對磷酸根進行保護，在整個多肽鏈合成完畢后再進行脫保護，反應工藝復雜，且磷酸化多肽產品收率較低。本發明提供一種改進的磷酸化多肽合成方法，合成操作方便簡單，反應條件溫和，便于磷酸化多肽的快速合成制備。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種磷酸化多肽的固相合成方法，該合成方法反應條件溫和、反應效率高、成本低、具有生產磷酸化多肽產品的廣泛應用前景。
本發明的目的可以通過以下技術方案實現
一種磷酸化多肽的固相合成方法，該固相合成方法包括以下具體步驟：
(1)選用2-Cl-Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc-保護氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對應的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；
(2)將磷酸化多肽-2-Cl-Resin進行切割沉降反應，純化并凍干，得到磷酸化多肽產品。
所述的起始氨基樹脂為2-Cl-Resin，取代度為0.64mmol/g。
步驟(1)中所述縮合反應過程中以DIC/HOBT為活化劑和縮合劑，以DMF溶液洗滌多肽樹脂，反應中氨基酸投料量為3倍所投樹脂摩爾數，縮合反應時間為30-60min；以20％Pip/DMF溶液為脫保護劑，洗脫時間為20min。
步驟(1)中所述縮合反應過程中以HBTU/DIEA為縮合試劑，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌多肽樹脂。
步驟(1)中所述Fmoc-保護氨基酸縮合順序依次為：Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH、Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH，縮合反應溫度為25℃。
步驟(2)中所述切割試劑為TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2體積比，切割液體積為反應器容積的1/2，樹脂切割兩次，將切割液分別吹入到冰乙醚中，離心沉淀去上清，重復操作3次。
步驟(2)中所述純化方法指采用高效液相色譜法純化用C18色譜柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈為流動相，以B.Cone/％(2→55)，Time/min(0→30)的梯度進行多肽的分離提純，凍干得到磷酸化多肽產品。
本發明的有益效果：本發明采用Fmoc固相合成法，以2-ClResin為固相載體，在縮合反應過程中采用不同的活化劑和縮合劑進行縮合反應，以及采用不同的洗滌方法洗滌多肽樹脂，提高了縮合效率，經切割沉降、純化得到磷酸化多肽產品。本發明大大縮短了反應時間，提高了產品的收率，具有可觀的經濟適用價值和廣泛的應用前景。
具體實施方式
通過下述實施例將有助于理解本發明，但不能限制本發明的內容。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單替換或推演，都視為屬于本發明的保護范圍。
實施例一
磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
1.2-Cl-Resin的溶脹
稱量取代度為0.64mmol/g的2-Cl-Resin1g，從開口端加入至多肽合成反應器中，取DCM試劑加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹0.5h。
2.磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
磷酸化多肽-2-Cl-Resin為：
TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC-2-Cl-Resin
本實施例使用的保護氨基酸從樹脂起算第1-18個氨基酸相對應的保護氨基酸及分子量如下表所示：
本發明中一些常用的縮寫具有以下含義：
Fmoc：芴甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰
Pip：六氫吡啶
TFA：三氟醋酸
Trt：三苯甲基
tBu：叔丁基
otBu：氧叔丁基
DIC：N,N-二異丙基碳化二亞胺
DIEA：N,N-二異丙基乙胺
HOBT：1-羥基苯并三唑
(1)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的合成
稱取210mg Fmoc-Cys(trt)-OH和230mg HOBT放于10ml離心管中，加5ml DCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應器中反應1h。
(2)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的封頭反應
配制甲醇：DIEA＝1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。
(3)樹脂的洗滌方法
用真空泵將反應器中的脫保護溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應器中溶液再加入DMF洗滌，重復操作3次。
(4)脫除Fmoc保護基
加入1/3-1/2反應器體積的20％哌啶/DMF脫保護溶液到抽干的反應器中，置于30r/min的脫色搖床上搖晃反應20min。
(5)保護氨基酸的活化方法
以Fmoc-Ser(tBu)-Cys(trt)-2-Cl-Resin的縮合為例，稱取684mg Fmoc-Ser(tBu)-OH和230mg HOBT放于10ml離心管中，加入5ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液。
(6)磷酸化氨基酸的縮合
以HBTU/DIEA為縮合試劑加入到反應器中，縮合反應30-60min后，用DMF溶液洗滌樹脂，然后按照上述方法脫除磷酸化氨基酸的Fmoc保護基，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌樹脂1次，之后再以DMF溶液洗滌樹脂3次。
(7)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
將上述活化的保護氨基酸溶液加到抽干的反應器中，再將反應器置于25℃的恒溫震蕩器中反應30-60min，洗滌，脫保護，再洗滌。采用上述同樣方法，依次縮合第2-18個Fmoc-保護氨基酸，即得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin。
實施例二
磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割沉降
(1)配置切割試劑
100ml配方為:87.5mlTFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mlEDT+5g苯酚，置于棕色試劑瓶中。現配備用，配制量一般為1g樹脂加10ml切割試劑。
(2)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割
向抽干的反應器中加入切割試劑，置于脫色搖床上搖晃反應1h，速度20r/min。切割結束后，加入約35ml冰乙醚至50ml離心管中，將反應器中溶液經砂芯過濾到冰乙醚中，蓋上離心管蓋子，上下震蕩離心管，混合均勻。將離心管放入離心機中，3000r/min，3min，離心棄上清，重復操作3次得到磷酸化多肽粗肽產品。
實施例三
磷酸化多肽的純化
切割沉降后的磷酸化多肽呈乳膠狀態，其中含有較多的TFA鹽和切割試劑，本發明采用C18色譜柱進行除鹽，以便計算粗品得率。
將樣品溶解并過濾，采用流動相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序進樣洗脫：
稱量凍干后的磷酸化多肽產品，經分析計算，產品純度為95％，其純品收率為71.8％，比現有技術僅30-50％的收率有大幅度提高。
以上內容僅僅是對本發明所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發明或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發明的保護范圍。