本發明屬于多肽藥物合成制備方法技術領域，具體涉及特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法。
背景技術：
中文名：醋酸曲普瑞林，英文名：Triptorelin Acetate
結構式：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2·HAC，分子式：C64H82N18O13，分子量：1311.46。
醋酸曲普瑞林是一種人工合成的促黃體素釋放素類似物，在天然LHRH的基礎上，利用D-Trp將LHRH肽鏈第六位上的Gly取代，產生一種生物學活性作用較強的合成促性腺激素釋放激素的相似物，其結構的改良增強了它和垂體受體的親和性并且減緩靶組織的鈍化作用，并且相較于天然LHRH，具備了更長的體內半衰期和更強的生物學穩定性。在臨床上主要用于治療子宮肌瘤，兒童真性性早熟，女性子宮內膜異位癥，在不孕癥的治療時可用于體外受精-胚胎移植過程。
目前，國內外關于醋酸曲普瑞林的合成純化方法報道不多，以下是四篇關于合成純化方法的專利情況；
在專利CN201410743707.1中公開了一種曲普瑞林的純化方法：采用固相制備曲普瑞林全保護的第一肽片段序列，液相制備曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列并脫除其氨基端保護基；液相中，脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與第一肽片段序列得到全保護的曲普瑞林；脫去全保護的曲普瑞林的側鏈保護基得到曲普瑞林粗肽，液相純化換鹽得到醋酸曲普瑞林，其是利用固液相結合片段縮合的方法制備曲普瑞林；
缺點：合成過程中需要經過多次切割，合成周期長，工藝復雜。
在專利CN200710044419.7公開了另一種曲普瑞林的純化方法：采用固相合成法合成曲普瑞林，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，獲得粗品，粗品經C18制備柱分離純化，凍干后，制得曲普瑞林精品；
缺點：得到的曲普瑞林總收率僅有25％左右。
在專利CN201310013712.2又一公開了一種曲普瑞林的純化方法，是將待純化的曲普瑞林用溶劑溶解并過濾得濾液，將所得濾液加載到離子交換柱上，用流動相洗脫并使曲普瑞林轉化成其鹽，收集主峰流出液；將所得流出液加載到硅膠柱上，用流動相洗脫，收集主峰洗脫液，除去溶劑，即得；
缺點：純化方法復雜，純化時間長、生產成本高，不利于規模化生產；
在專利CN201310074154.0再公開了一種曲普瑞林的純化方法：首先用含有機溶劑的水溶液溶解樣品，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸或硫酸的緩沖鹽為A相，乙腈為B相，進行梯度洗脫；然后，采用反相HPLC方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，將曲普瑞林磷酸鹽轉成醋酸鹽、凍干得到醋酸曲普瑞林；
缺點:曲普瑞林的總收率僅在30％左右。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種純化收率高、過程簡單、時間短的合成制備醋酸曲普瑞林的方法，具體是通過以下方案實現的：
特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法，操作步驟如下：
步驟一：以溶脹、脫保護并洗滌后的取代度為0.3～0.5mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂為起始樹脂載體，依次與活化的保護氨基酸溶液于恒溫震蕩器中反應，通過固相合成法的縮合反應接入相對應的保護氨基酸，得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
步驟二：對曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液進行脫保護并洗滌，得到固體顆粒；該固體顆粒用于進行切割反應，沉降后，得到曲普瑞林粗肽Ⅱ；
步驟三：對曲普瑞林粗肽Ⅱ進行純化，純化選用C4填料制備柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸或乙腈為流動相，以B.Cone/％(5→70)，0→60min的梯度程序進行多肽的分離提純，得到醋酸曲普瑞林。
所述固相合成法的縮合反應溫度為20-40℃，縮合反應所使用的活化劑為DIC，縮合劑為HOBT。
在氨基酸縮合反應后，再用微波進行10-20秒的合成反應，提高縮合效率。
氨基樹脂的溶脹溶劑為DCM，浸泡2小時以上。
將保護氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到所述活化的保護氨基酸溶液；
步驟一和步驟二中所述的脫保護并洗滌的操作如下：
(1)將溶液抽干后，加入體積為反應器容積1/3-1/2的20％哌啶和DMF的混合溶液，將裝有混合溶液的反應器置于轉速為30r/min的脫色搖床上，振搖20min后，將溶液抽干；(2)再向抽干溶液后的反應器中加入體積為反應器容積1/3-1/2的DMF溶液，并再次將反應器置于脫色搖床上，振搖60s-90s后，將溶液抽干；(3)重復(2)的操作三次。
步驟二中所述的切割反應的反應試劑為TFA、TIS和H2O的混合液。
所述切割反應是在20r/min的振搖條件下進行的，反應時間為38-42min。
對切割反應后含有曲普瑞林粗肽Ⅱ的溶液用-20℃低溫預冷的無水乙醚溶液進行離心沉降，得到乳膠狀的粗肽Ⅱ。
所述的保護氨基酸為：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH。
本發明的有益技術效果：
(1)本發明中通過降低流動性PH值以提高離子配對能力，有利于純化并提高純度，并且優化了純化梯度，縮短了純化時間，節省了純化流動相的使用，降低了生產成本；以乙酸代替三氟乙酸調節流動相PH，避免了最終產品中含有三氟乙酸，降低產品毒性，簡化了工藝流程。
(2)本發明利用Fmoc固相合成原理，開發了固相合成技術，采用常見易得、低成本的試劑縮合反應，并采用特有的純化工藝條件，使得曲普瑞林粗品收率高達80％以上，其純品收率達到50％，大大提高了曲普瑞林的收率；本發明操作簡單，合成周期短，生產成本低，副產物少，產品收率高，利于工業化生產。
(3)本發明改善了異構化現象，利用微波技術特有能量打破序列由于合成產生的二級結構，從而提高多肽的生物活性，實現了高活性、高收率的生產工藝目的。
(4)本發明采用純化工藝進行曲普瑞林粗肽的純化，產品純度達到99％，產品收率達到50％以上，在保證收率的同時大大縮短了生產周期，降低了生產成本，有利于大量生產，具有良好的市場應用前景。
具體實施方式
為了便于本領域技術人員理解，下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1:特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法，操作步驟如下：
(1)：起始樹脂載體的目標氨基樹脂的制備
將取代度為0.38mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂0.1g，從開口端加入至多肽合成反應器中，取DCM試劑加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹2h；
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3反應器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應20min，然后用真空泵將脫保護溶液抽干；再加入1/3反應器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復操作2次；使用茚三酮顯色檢測，合格后得到目標氨基樹脂；
(2)：保護氨基酸的制備
將保護氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到活化的保護氨基酸溶液；
保護氨基酸為：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH；
以Fmoc-Gly-OH為例，稱取22mg Fmoc-Gly-OH和12mg HOBT于離心管中，加2ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液；
(3)：曲普瑞林樹脂I的合成
將上述的保護氨基酸溶液依次加到抽干的裝有目標氨基樹脂的反應器中，保護氨基酸的投料量為所投氨基樹脂摩爾數的2倍，活化劑為DIC，縮合劑為HOBT；將反應器置于30℃的恒溫震蕩器中反應10min，使用微波縮合15s。采用上述同樣方法，依次接入第2-10個氨基酸對應的Fmoc-保護氨基酸，即得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-氨基樹脂。
(4)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的合成
將曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/2反應器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復操作三次。
將反應器中的樹脂溶液用真空泵抽干至顆粒狀，配置10ml切割試劑：9.5ml TFA+0.25ml TIS+0.25ml H2O，加入到反應器中，于20r/min的搖晃條件下切割反應40min；
切割反應后，多肽的沉降選用-20℃低溫預冷的無水乙醚，離心沉降三次，得到乳膠狀的粗肽樣品；
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品32mg，根據粗品的量和合成測定實際取代度(SD＝0.3mmol/g)計算的理論量，計算粗品收率達到82.3％，比現有技術僅50-60％的收率有大幅度成倍的提高。
(5)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的純化
用20％乙腈和水的混合溶液溶解曲普瑞林粗品Ⅱ，經反相高效液相色譜法純化得到曲普瑞林多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為21.4mg，經分析計算，曲普瑞林純度達到99.2％，其純品收率達到53.6％。
實施例2:
(1)：起始樹脂載體的目標氨基樹脂的制備
將取代度為0.45mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂2g，從開口端加入至多肽合成反應器中，取DCM試劑加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹8h；
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應20min，然后用真空泵將脫保護溶液抽干；再加入1/2反應器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復操作2次,使用茚三酮顯色檢測，合格后得到目標氨基樹脂；
(2)：保護氨基酸的制備
將保護氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到活化的保護氨基酸溶液；
保護氨基酸為：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH；
以Fmoc-Gly-OH為例，稱取500mg Fmoc-Gly-OH和250mg HOBT于離心管中，加12ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液；
(3)：曲普瑞林樹脂I的合成
將上述的保護氨基酸溶液依次分別加到抽干的裝有目標氨基樹脂的反應器中，保護氨基酸的投料量為所投氨基樹脂摩爾數的2倍，活化劑為DIC，縮合劑為HOBT；將反應器置于30℃的恒溫震蕩器中反應45min，使用微波縮合20s。采用上述同樣方法，依次接入第2-10個氨基酸對應的Fmoc-保護氨基酸，即得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-氨基樹脂。
(4)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的合成
將曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/2反應器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復操作三次。
將反應器中的樹脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置100ml切割試劑：95mlTFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O，加入到反應器中，于20r/min的搖晃條件下切割反應40min；多肽的沉降選用-20℃低溫預冷的無水乙醚，離心沉降三次，得到乳膠狀的粗肽樣品；
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品746mg，根據粗品的量和合成測定實際取代度(SD＝0.36mmol/g)計算的理論量，計算粗品收率達到81.3％，比現有技術僅50-60％的收率有大幅度成倍的提高。
(5)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的純化
用20％乙腈和水的混合溶液溶解曲普瑞林粗品Ⅱ，經反相高效液相色譜法純化得到曲普瑞林多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為441.5mg，經分析計算，曲普瑞林純度達到99.1％，其純品收率達到53.1％。
本發明采用了固相合成技術，使用常見易得、低成本的試劑縮合反應，并采用特有的純化工藝條件，使得曲普瑞林粗品收率高達80％以上，其純品收率達到50％，合成周期短、生產成本低、副產物少、收率高，利于工業化生產。
實施例1和實施例2中使用的保護氨基酸從樹脂起算第1-10個氨基酸相對應的保護氨基酸及分子量如下表1所示；
表1
實施例1和實施例2中使用的英文縮寫的含義如下表2所示。
表2
以上內容僅僅是對本發明所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發明或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發明的保護范圍。