本發明涉及一種高純青蒿素的生物提取方法，屬于植物藥有效成分提取技術領域。
背景技術：
青蒿素是指復合花序植物黃花蒿（即中藥青蒿）葉中提取得到的一種無色針狀晶體，它的莖中不含藥青蒿。分子式為C15H22O5。是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾，具有速效和低毒的特點的有效藥物，曾被世界衛生組織稱做是“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。抗瘧疾作用機理主要在于在治療瘧疾的過程通過青蒿素活化產生自由基，自由基與瘧原蛋白結合，作用于瘧原蟲的膜系結構，使其泡膜、核膜以及質膜均遭到破壞，線粒體腫脹，內外膜脫落，從而對瘧原蟲的細胞結構及其功能造成破壞。根據世衛組織的統計數據，自2000年起，撒哈拉以南非洲地區約2.4億人口受益于青蒿素聯合療法，約150萬人因該療法避免了瘧疾導致的死亡。因此，很多非洲民眾尊稱其為東方神藥。
目前現有以青蒿酸為原料制備青蒿素提取回收率極低，在10%以內，工藝流程十分復雜，需要反復柱層析，且青蒿素和其生物及化學合成前體的制備方法，工藝流程復雜、提取回收率低、僅單一提取純化青蒿素、溶劑易燃易爆，同時提取后的青蒿素對胚胎有較高的選擇性毒性，較低劑量即可使胚胎死亡而導致流產，注射部位淺時，易引起局部疼痛和硬塊，安全型較差，所以急需一種安全型較強、提取率較高的青蒿素提取方法。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題：針對目前現有提取的青蒿素對胚胎有較高的毒性，安全性較低，且工藝流程十分復雜，需要反復柱層析的問題，提供了一種高純青蒿素的生物提取方法，本發明通過制備出一種無菌復合培養基，將含有青蒿素的黃花蒿接種培養，以吲哚乙酸導流，富集于葉片，經腐爛、水解、發霉、最終收集霉菌，過柱洗脫，蒸餾得一種無生物毒性的青蒿素選本發明將富集青蒿素的葉片進行水解，葉片中植物蛋白水解形成的多肽和氨基酸與青蒿素中過氧基團進行復合，改善青蒿酸生物毒性，可使青蒿素安全性大大增強，從而降低對生物安全的威脅。
為解決上述技術問題，本發明采用如下所述的技術方案是：
（1）選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3～5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質量比1:8，將其與質量分數75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3～5h后，用紫外燈滅菌處理10～15min，隨后在無菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm2的嫩葉葉片，備用；
（2）按重量份數計，分別稱量1～2份六芐氨基嘌呤、2～3份激動素、2～3份吲哚乙酸和3～5份2,4-二氯苯氧乙酸和15～20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調節液，按質量比1:5;25，將激素調節液、豆粕和MS培養基混合，制備得初級培養基；
（3）將上述制備的初級培養基置于28～32℃發酵處理2～3天，過濾并收集濾液，在120～125℃下滅菌處理10～15min，在3500～4000r/min下離心分離10～15min，收集上層清液，再按質量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45～50℃下水浴加熱1～2h，制備得青蒿酸混合液；
（4）按質量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10～15min，制備得無菌復合培養基，按質量比1:25，將步驟（1）制備的嫩葉葉片接種至無菌復合培養基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，將3g/L吲哚乙酸無水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24～28℃下弱光培養10～12天，控制光強為15～20Lx；
（5）待培養完成后，收集葉片并密封發酵5～7天，待發酵完成后，將其搗碎并質量4500～6000r/min離心分離10～15min，隨后過濾并收集上層清液，，將上層清液通過Sephadex LH-20凝膠柱進行洗脫處理，控制凝膠柱中流動相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。
本發明的應用方法：按重量份數計，分別稱量1～2份本發明制得的青蒿素、10～15份淀粉、7～8份質量分數5%羧甲基淀粉溶液、2～3份硬脂酸鎂和25～30份去離子水攪拌混合，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進行服用，經檢測，本發明可使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過敏率為0.3%，安全性較強。
本發明與其他方法相比，有益技術效果是：
（1）本發明制得的青蒿素可使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量減少90%以上；
（2）本發明制得的青蒿素人體過敏率低于0.5%，安全性較強；
（3）本發明制得的青蒿素原料環保無公害，對環境無污染。
具體實施方式
首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3～5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質量比1:8，將其與質量分數75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3～5h后，用紫外燈滅菌處理10～15min，隨后在無菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm2的嫩葉葉片，備用；按重量份數計，分別稱量1～2份六芐氨基嘌呤、2～3份激動素、2～3份吲哚乙酸和3～5份2,4-二氯苯氧乙酸和15～20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調節液，按質量比1:5;25，將激素調節液、豆粕和MS培養基混合，制備得初級培養基；將上述制備的初級培養基置于28～32℃發酵處理2～3天，過濾并收集濾液，在120～125℃下滅菌處理10～15min，在3500～4000r/min下離心分離10～15min，收集上層清液，再按質量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45～50℃下水浴加熱1～2h，制備得青蒿酸混合液；按質量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10～15min，制備得無菌復合培養基，按質量比1:25，將嫩葉葉片接種至無菌復合培養基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，將3g/L吲哚乙酸無水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24～28℃下弱光培養10～12天，控制光強為15～20Lx；待培養完成后，收集葉片并密封發酵5～7天，待發酵完成后，將其搗碎并質量4500～6000r/min離心分離10～15min，隨后過濾并收集上層清液，將上層清液通過Sephadex LH-20凝膠柱進行洗脫處理，控制凝膠柱中流動相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。
實例1
首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質量比1:8，將其與質量分數75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3h后，用紫外燈滅菌處理10min，隨后在無菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm2的嫩葉葉片，備用；按重量份數計，分別稱量1份六芐氨基嘌呤、2份激動素、2份吲哚乙酸和3份2,4-二氯苯氧乙酸和15份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調節液，按質量比1:5;25，將激素調節液、豆粕和MS培養基混合，制備得初級培養基；將上述制備的初級培養基置于28℃發酵處理2天，過濾并收集濾液，在120℃下滅菌處理10min，在3500r/min下離心分離10min，收集上層清液，再按質量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45℃下水浴加熱1h，制備得青蒿酸混合液；按質量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10min，制備得無菌復合培養基，按質量比1:25，將嫩葉葉片接種至無菌復合培養基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，將3g/L吲哚乙酸無水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24℃下弱光培養10天，控制光強為15Lx；待培養完成后，收集葉片并密封發酵5天，待發酵完成后，將其搗碎并質量4500r/min離心分離10min，隨后過濾并收集上層清液，將上層清液通過Sephadex LH-20凝膠柱進行洗脫處理，控制凝膠柱中流動相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。
按重量份數計，分別稱量1份本發明制得的青蒿素、10份淀粉、7份質量分數5%羧甲基淀粉溶液、2份硬脂酸鎂和25份去離子水攪拌混合，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進行服用，經檢測，本發明可使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過敏率為0.3%，安全性較強。
實例2
首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌4次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質量比1:8，將其與質量分數75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理4h后，用紫外燈滅菌處理12min，隨后在無菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm2的嫩葉葉片，備用；按重量份數計，分別稱量2份六芐氨基嘌呤、3份激動素、3份吲哚乙酸和4份2,4-二氯苯氧乙酸和17份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調節液，按質量比1:5;25，將激素調節液、豆粕和MS培養基混合，制備得初級培養基；將上述制備的初級培養基置于29℃發酵處理2天，過濾并收集濾液，在122℃下滅菌處理12min，在3750r/min下離心分離12min，收集上層清液，再按質量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在47℃下水浴加熱2h，制備得青蒿酸混合液；按質量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養基攪拌混合，紫外燈滅菌處理12min，制備得無菌復合培養基，按質量比1:25，將嫩葉葉片接種至無菌復合培養基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，將3g/L吲哚乙酸無水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在27℃下弱光培養11天，控制光強為17Lx；待培養完成后，收集葉片并密封發酵6天，待發酵完成后，將其搗碎并質量5200r/min離心分離12min，隨后過濾并收集上層清液，將上層清液通過Sephadex LH-20凝膠柱進行洗脫處理，控制凝膠柱中流動相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。
按重量份數計，分別稱量2份本發明制得的青蒿素、12份淀粉、8份質量分數5%羧甲基淀粉溶液、3份硬脂酸鎂和27份去離子水攪拌混合，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進行服用，經檢測，本發明可使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過敏率為0.3%，安全性較強。
實例3
首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質量比1:8，將其與質量分數75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理5h后，用紫外燈滅菌處理15min，隨后在無菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm2的嫩葉葉片，備用；按重量份數計，分別稱量2份六芐氨基嘌呤、3份激動素、3份吲哚乙酸和5份2,4-二氯苯氧乙酸和20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調節液，按質量比1:5;25，將激素調節液、豆粕和MS培養基混合，制備得初級培養基；將上述制備的初級培養基置于32℃發酵處理3天，過濾并收集濾液，在125℃下滅菌處理15min，在4000r/min下離心分離15min，收集上層清液，再按質量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在50℃下水浴加熱2h，制備得青蒿酸混合液；按質量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養基攪拌混合，紫外燈滅菌處理15min，制備得無菌復合培養基，按質量比1:25，將嫩葉葉片接種至無菌復合培養基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，將3g/L吲哚乙酸無水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在28℃下弱光培養12天，控制光強為20Lx；待培養完成后，收集葉片并密封發酵7天，待發酵完成后，將其搗碎并質量6000r/min離心分離15min，隨后過濾并收集上層清液，將上層清液通過Sephadex LH-20凝膠柱進行洗脫處理，控制凝膠柱中流動相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。
按重量份數計，分別稱量2份本發明制得的青蒿素、15份淀粉、8份質量分數5%羧甲基淀粉溶液、3份硬脂酸鎂和30份去離子水攪拌混合，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進行服用，經檢測，本發明可使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過敏率為0.3%，安全性較強。