基于金?上轉換納米粒子四面體的雙信號原位檢測胞內microRNA的方法與流程
基于金-上轉換納米粒子四面體的雙信號原位檢測胞內microRNA的方法，屬于材料化學生物領域。
背景技術：
MicroRNA（miRNA）是一類小分子的非編碼調控基因（19~22 堿基），廣泛地存在于植物、動物及病毒基因之中。miRNA 在細胞分化、增殖、凋亡及癌變等生物過程中都扮演著重要的角色，miRNA 的表達水平與人類的重大疾病，尤其癌癥，密切相關。傳統的miRNA檢測方法局限于胞內miRNA成像以及基于熒光信號的定量檢測。但是熒光信號的光不穩定性、短的量子壽命、易光漂白等特性大大限制了基于熒光信號的胞內原位檢測方法的應用。
由納米粒子可控自組裝的納米結構有規則的幾何形狀，穩定的結構，很強的光學活性。基于這些性質，自組裝的納米結構已經被廣泛的應用于生物傳感。但是基于納米組裝結構的胞內microRNA的檢測還沒有報導。近年來，手性等離子光學活性已經成為一個熱點話題引起了廣泛的關注。發展了很多基于手性納米組裝體的超靈敏的傳感檢測方法來檢測核酸片段和血液中的癌癥標志物。但是，在生物領域活的癌細胞中的應用仍然有待探索。
近年來，手性自組裝納米材料獲得了廣泛的關注。本發明建立了一種基于金-上轉換納米粒子四面體的雙信號原位檢測胞內microRNA的檢測方法，是一種超靈敏，高特異性的胞內microRNA的原位檢測方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種基于手性金-上轉換納米粒子四面體的雙模態信號的胞內microRNA的超靈敏檢測方法。
本發明的技術方案，基于金-上轉換納米粒子四面體的發光信號和手性信號原位檢測細胞中microRNA的方法，包括制備檢測探針所用核酸的設計，金-上轉換納米粒子四面體檢測探針的制備，四面體的功能化，胞內microRNA檢測方法的建立；具體步驟為:
（一）檢測方法的建立
（1）20nm金納米粒子的制備
潔凈的三口燒瓶中加入 97.5mL 超純水，加入2.5mL 0.4% 氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8min 后加入1.6mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色后，停止加熱，繼續攪拌15min，自然冷卻后放置在4℃冰箱備用。
（2）19nm上轉換納米粒子(NaGdF4:Yb,Er)的制備
在含有14mL OA（配體十八烯酸）和16mL ODE（非配位有機溶劑十八烯）的混合液中加入0.80mmol的GdCl3? 6H2O，0.18mmol 的YbCl3 ?6H2O 和0.02mmol的ErCl3 ? 6H2O，溶解。在氮氣的保護下加熱到150℃形成均相的溶液。降至室溫后，含有0.100g的 NaOH和0.148g的NH4F的10 mL甲醇溶液慢慢加入。反應混合液在50℃下慢慢攪拌30min，然后在100℃在真空下處理10min除去甲醇，在氮氣的保護下加熱到320℃，并且保持1h。將混合物降至室溫，反應結束。乙醇中沉淀的合成的NaGdF4粒子用離心收集，并用乙醇洗滌幾次，最后重懸在THF或者環己烷溶液中供后續實驗使用。上轉換納米粒子的轉相：100mg用馬來酰亞胺基團和磷酸基團修飾的PEG和10mg 油酸包裹的NaGdF4粒子混合在THF溶液里面，在室溫下攪拌過夜。PEG包裹的NaGdF4粒子在環己烷中沉淀，并用環己烷洗滌三次，在室溫真空的條件下干燥，得到了可以在水中溶解的PEG包裹的NaGdF4粒子。
（3）檢測用的核酸探針的設計與合成
表1. microRNA檢測用DNA序列設計
注：本發明所使用的 DNA 均購自中國上海生工生物工程有限公司，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化。
（4）金-上轉換納米粒子四面體檢測探針的制備
首先制備金納米粒子和核酸的偶聯物：把20nM金納米粒子（AuNP）分別和DNA-Py3，DNA-Py4按摩爾比1︰3.5的比例混合在一起，反應1h后加入NaCl溶液至終溶度為50mM，混合均勻，反應過夜，離心去除游離的核酸，即得到AuNP-DNA-Py 3，AuNP-DNA-Py 4。然后制備上轉換納米粒子和核酸的偶聯物：把20nM上轉換納米粒子（UCNP）分別和DNA-Py1，DNA-Py2按摩爾比1︰3.5比例混合在一起，反應1h后加入NaNO3溶液至終溶度為50mM，混合均勻，反應過夜，離心去除游離的核酸，即得到UCNP-DNA-Py1，UCNP-DNA-Py 2。接下來把得到的AuNP-DNA-Py3和AuNP-DNA-Py4，UCNP-DNA-Py1和UCNP-DNA-Py 2分別混合，加入NaCl至終濃度為50mM，95℃水浴5min，然后37℃孵育8h，即得到金二聚體及上轉換二聚體。把金二聚體和上轉換二聚體按照摩爾比1︰1的比例混合，37℃孵育24h，即制備得到檢測microRNA-21用的金-上轉換納米粒子四面體檢測探針溶液。
（5）四面體的功能化
將巰基修飾的PEG（分子量：5000）溶液按照PEG︰四面體摩爾比1000︰1的比例加入到四面體檢測探針溶液中，15min后離心除去多余的PEG分子。然后把穿膜肽分子（TAT）按照TAT︰四面體摩爾比1000︰1的比例加入到PEG修飾過的四面體溶液中，室溫反應24h，離心除去多余的未連在四面體上的穿膜肽。
（6）活細胞內microRNA-21檢測方法的建立
首先用商業轉染試劑(lipofectamine RNAiMAX transfection reagent)和不同量的microRNA-21來增加細胞中microRNA-21的量，或者用microRNA-21的反義序列來降低細胞中的microRNA-21的量，然后用RT-PCR來確定轉染后細胞中的microRNA-21的量。具體方法如下：首先建立人工合成的有梯度的microRNA-21的擴增曲線，然后建立循環數和microRNA-21的濃度之間的線性關系。然后提取轉染后的細胞中的總RAN，然后用RT-PCR擴增得到里面含有microRNA-21的擴增曲線，根據擴增曲線得到循環數，然后根據循環數從標準曲線中確定含有的microRNA-21，然后用含有四面體的培養基(1640+10%FBS+雙抗)來培養轉染后的細胞，8h后洗去細胞外面的四面體，測定細胞內的CD信號及上轉換熒光強度，然后分別建立CD信號和細胞內microRNA-21的濃度的標準曲線以及上轉換熒光強度與細胞內microRNA-21的濃度之間的標準曲線。
（7）不同細胞中microRNA-21的檢測
用含有四面體的培養基（1640+10%FBS+雙抗）分別培養MCF-7，HeLa, PCS-460-010細胞，8h后，檢測細胞中的CD信號及上轉換熒光強度，然后根據分別建立CD信號和細胞內microRNA-21的濃度的標準曲線以及上轉換熒光強度與細胞內microRNA-21的濃度之間的標準曲線來確定細胞中microRNA-21的含量。
本發明的有益效果：本發明將DNA驅使的金-上轉換納米粒子組裝的四面體用于胞內miRNA的實時檢測。金-上轉換納米粒子四面體具有雙重的光學活性，在521nm呈現了很強的等離子圓二色譜信號，并在500-600nm有顯著的上轉換熒光強度，因此可以利用這雙重信號來檢測細胞中的miRNA。在目標miRNA的存在下，CD信號會減弱，熒光強度會增強。實驗結果顯示，CD信號與目標miRNA濃度在0.073 到 43.65 fmol/10μg RNA范圍內有很好的線性關系，檢測限可以達到0.03 fmol/10μg RNA，而上轉換熒光強度與目標miRNA濃度的線性范圍是0.16 - 43.65 fmol/10μg RNA，最低檢測限是0.12 fmol/10μg RNA。這些結果說明了CD信號對miRNA的濃度變化比熒光強度有更高的靈敏度。強的CD信號來自于光子自旋角動量的相互作用以及四面體中DNA分子對手性的增強作用。
本發明不僅建立了胞內miRNA的超靈敏定量檢測方法，同時也為組裝體等離子手性的生物應用開辟了道路。本發明建立了一種基于金-上轉換納米粒子四面體的雙信號原位檢測胞內microRNA的檢測方法，是一種超靈敏，高特異性的胞內microRNA的原位檢測方法。
附圖說明
圖1(A)金-上轉換納米粒子四面體檢測細胞中microRNA的示意圖；(B)四面體的核酸骨架，1和2的位點與上轉換納米粒子聯接，3和4的位點與金納米粒子聯接。
圖2組裝的四面體的透射電鏡圖。
圖3組裝的四面體的產率統計圖。
圖4細胞外檢測能力的評價：(A) 添加一系列不同濃度得到的手性信號圖； (B)添加一系列不同濃度得到的熒光信號圖。
圖5檢測特異性的評價：(C) 添加不同種類的microRNA得到的手性信號圖；(D)添加不同種類的microRNA得到的熒光信號圖。
圖6細胞內microRNA檢測的CD信號圖。
圖7細胞內microRNA檢測的上轉換發光圖。
圖8 CD信號的強度與細胞內microRNA的量之間的標準曲線。
圖9上轉換熒光強度與細胞內microRNA的量之間的標準曲線。
圖10用所建立的細胞內檢測microRNA的方法檢測不同細胞中的microRNA的CD信號圖。
圖11用所建立的細胞內檢測microRNA的方法檢測不同細胞中的microRNA的上轉換發光圖。
具體實施方式
實施例1 金納米粒子和上轉換納米粒子(NaGdF4:Yb,Er)的制備
（1）20nm金納米粒子的制備
潔凈的三口燒瓶中加入 97.5mL 超純水，加入2.5mL 0.4% 氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8min 后加入1.6mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色后，停止加熱，繼續攪拌15min。自然冷卻后放置在4℃冰箱備用。
（2）19nm上轉換納米粒子(NaGdF4:Yb,Er)的制備
在含有14mL OA（配體十八烯酸）和16mL ODE（非配位有機溶劑十八烯）的混合液中加入0.80mmol的GdCl3? 6H2O，0.18mmol 的YbCl3 ?6H2O 和0.02mmol的ErCl3 ? 6H2O，溶解。在氮氣的保護下加熱到150℃形成均相的溶液。降至室溫后，含有0.100 g的 NaOH和0.148 g的NH4F的10 mL甲醇溶液慢慢加入。反應混合液在50℃下慢慢攪拌30min，然后在100℃在真空下處理10min除去甲醇，在氮氣的保護下加熱到320℃，并且保持1h。將混合物降至室溫，反應結束。乙醇中沉淀的合成的NaGdF4粒子用離心收集，并用乙醇洗滌幾次，最后重懸在THF或者環己烷溶液中供后續實驗使用。上轉換納米粒子的轉相：100mg用馬來先亞胺基團和磷酸基團修飾的PEG和10mg 油酸包裹的NaGdF4粒子混合在THF溶液里面，在室溫下攪拌過夜。PEG包裹的NaGdF4粒子在環己烷中沉淀，并用環己烷洗滌三次，在室溫真空的條件下干燥，得到了可以在水中溶解的PEG包裹的NaGdF4粒子。
實施例2
microRNA檢測用DNA序列設計
注：本發明所使用的 DNA 均購自中國上海生工生物工程有限公司，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化。
實施例3 檢測探針的制備
首先制備金納米粒子和核酸的偶聯物：把20nM的金納米粒子（AuNP）分別和DNA1-Py3，DNA-Py4按摩爾比1︰3.5的比例混合在一起，反應1h后加入NaCl溶液至終溶度為50mM，混合均勻，反應過夜，離心去除游離的核酸，即得到AuNP-DNA-Py3，AuNP-DNA-Py4。然后制備上轉換納米粒子和核酸的偶聯物：把20nM上轉換納米粒子（UCNP）分別和DNA-Py1，DNA-Py2按摩爾比1︰3.5的比例混合在一起，反應1h后加入NaNO3溶液至終溶度為50mM，混合均勻，反應過夜，離心去除游離的核酸，即得到UCNP-DNA-Py1，UCNP-DNA-Py2。接下來把得到的AuNP-DNA-Py3和AuNP-DNA-Py4，UCNP-DNA-Py1和UCNP-DNA-Py2分別混合，加入NaCl至終濃度為50mM，95℃水浴5min，然后37℃孵育8h，即得到金二聚體及上轉換二聚體。把金二聚體和上轉換二聚體按照摩爾比1︰1的比例混合，37℃孵育24h，即制備得到檢測microRNA-21用的金-上轉換納米粒子四面體檢測探針溶液。
實施例4 四面體的功能化
將巰基修飾的PEG（分子量：5000）溶液按照PEG︰四面體摩爾比1000︰1的比例加入到四面體檢測探針溶液中，15min后離心除去多余的PEG分子。然后把穿膜肽分子（TAT）按照TAT︰四面體摩爾比1000︰1的比例加入到PEG修飾過的四面體溶液中，室溫反應24h，離心除去多余的未連在四面體上的穿膜肽。
實施例5 活細胞內microRNA-21檢測方法的建立
首先用商業轉染試劑(lipofectamine RNAiMAX transfection reagent)和不同量的microRNA-21來增加細胞中microRNA-21的量，或者用microRNA-21的反義序列來降低細胞中的microRNA-21的量，然后用RT-PCR來確定轉染后細胞中的microRNA-21的量。具體方法如下：首先建立人工合成的有梯度的microRNA-21的擴增曲線，然后建立循環數和microRNA-21的濃度之間的線性關系。然后提取轉染后的細胞中的總RAN,然后用RT-PCR擴增得到里面含有microRNA-21的擴增曲線，根據擴增曲線得到循環數，然后根據循環數從標準曲線中確定含有的microRNA-21的量（濃度），然后用含有四面體的培養基(1640+10%FBS+雙抗)來培養轉染后的細胞（如MCF-7），8h后洗去細胞外面的四面體，測定細胞內的CD信號和上轉換熒光強度。然后分別建立CD信號和細胞內microRNA-21的濃度的標準曲線以及上轉換熒光強度與細胞內microRNA-21的濃度之間的標準曲線。
實施例6 不同細胞中microRNA-21的檢測
用含有四面體的培養基(1640+10%FBS+雙抗)分別培養MCF-7，HeLa，PCS-460-010細胞，8h后檢測細胞中的CD信號及上轉換熒光強度，然后根據分別建立CD信號和細胞內microRNA-21的濃度的標準曲線以及上轉換熒光強度與細胞內microRNA-21的濃度之間的標準曲線來確定細胞中microRNA-21的含量。
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