胰島素核酸適體INS5及其制備方法與流程

本發明屬于蛋白檢測技術領域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的胰島素核酸適體及其制備方法。

背景技術：

胰島素是由胰臟內的胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。

胰島素的生物合成速度受血漿葡萄糖濃度的影響，當血糖濃度升高時，β細胞中胰島素原含量增加，胰島素合成加速。胰島素在胰島β細胞中合成。胰島素的分子量5700，由兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個氨基酸，B鏈有30個氨基酸。A-B 鏈之間有兩處二硫鍵相連。胰島素是與C肽以相等分子分泌進入血液的。臨床上使用胰島素治療的病人，血清中存在胰島素抗體，影響放射免疫方法測定血胰島素水平，在這種情況下可通過測定血漿C肽水平，來了解內源性胰島素分泌狀態。

目前胰島素的檢測方法有三大類：色譜法、免疫學法、循環酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標準化；而且HPLC設備價格昂貴、技術條件要求高，需專門的維護人員，使其推廣困難。免疫學法需要還原游離INS形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測游離型同型半胱胺酸，只能檢測血漿總同型半胱胺酸，用還原劑在37℃半小時卵育對血樣進行還原處理。免疫學法需一小時以上才能出結果，操作步驟繁瑣，因為需要進行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環酶法過程繁瑣，且檢測限低、產生誤差較大，價格昂貴，故得不到推廣。

核酸適配體是近年發展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學家的廣泛關注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術已被報道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準上市。SELEX技術篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子, 國內其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體或核酸適配體等。SELEX 技術是指應用化學法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機序列組成) 文庫,通過施加選擇壓力(結合靶目標，淘選與靶目標高度特異結合片段的過程), 并結合體外擴增技術, 經過多輪的循環選擇富集, 獲得與靶物質高度特異結合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長度一般為25~ 60 個核苷酸。

由上可知，核酸適體與靶物質結合所呈現的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應用前景, 盡管目前成熟的臨床應用報道較少, 但應用適體檢測類胰島素的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測新技術也不斷出現。但是目前基于核酸適體的針對于胰島素的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于胰島素的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報道。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服現有的胰島素檢測技術的不足，填補還未見胰島素的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種胰島素核酸適體及其制備方法，本發明所提供的核酸適體命名INS5。

本發明的方案是通過這樣實現的：一種胰島素核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列其序列為：taggcctcgg acgttatata cacgatctct acgaccgttc tggctgcgtt tcggactgt。

以上所述胰島素核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種：

（1）將權利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；

（2）權利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；

（3）權利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸；

（4）權利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。

一種以上所述胰島素核酸適體或其衍生物在識別、檢測胰島素，或者制備檢測胰島素的試劑盒方面的應用。

為了使本發明公開充分，本發明胰島素核酸適體的制備方法步驟如下：

胰島素核酸適體的制備方法包括以下步驟：

1） 合成單鏈DNA隨機序列寡核苷酸庫：所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，作為PCR擴增引物結合區，中間為60個堿基的隨機序列，庫容量10¹⁵以上。所述PCR引物為：

引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’

所述PCR引物2帶有5’端生物素標記。

2）制備連接胰島素的固相基質：以微磁珠為基質，通過化學方法把胰島素通過其羧基共價連接到微磁珠上。

3） 初次篩選目的寡核苷酸序列：將DNA隨機寡核苷酸庫與胰島素混合，篩選除去DNA隨機寡核苷酸庫中不結合和非特異結合胰島素的寡核苷酸序列，回收特異結合胰島素的核酸序列。

4） 制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫：將步驟3中所得與胰島素特異結合的寡核苷酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈霉親和素微磁珠為基質進行分離，經過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選。

5） 篩選并鑒定胰島素核酸適體：將步驟4所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫進行下一輪篩選，經過15輪篩選后獲得目標寡核酸序列。克隆并測序所述目標寡核酸序列，通過酶聯核酸適體吸附測定法鑒定其與胰島素結合的特異性和親和力。

6） 所述胰島素核酸適體可作為檢測試劑用于檢測胰島素。

本發明的有益效果如下：（1）所篩選到的核酸適體分子量小，無毒性，有利于分子探針的設計，易于合成與標記；（2）核酸適體只特異的識別胰島素，不結合非胰島素和其它胰島素分子，結合胰島素的能力是結合非胰島素Hb的能力的20~80倍，可以成為鑒別胰島素的試劑，提高檢測方法的特異性和靈敏度，簡化檢測方法，降低成本。

附圖說明

圖1為本發明核酸適體與胰島素的結合能力，圖1中橫坐標為核酸適體DNA濃度，縱坐標為解離常數(Kd)相對值，圖中INS曲線表示核酸適體INS5與胰島素的結合曲線，IN曲線表示核酸適體INS4與非胰島素（類胰島素IN）的結合曲線。

具體實施方式

實施1 胰島素特異結合的核酸適體INS5的制備

構建隨機序列寡核苷酸庫：人工合成單鏈DNA序列，構建庫容量為1×10⁵的單鏈DNA隨機序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機寡核苷酸庫包括的DNA序列為：

5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA-N_25~40-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3’

所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機序列N_25~60和兩端固定序列，所述中間隨機序列N_25~40為30~40個堿基的隨機序列，所述兩端固定序列為：5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA，3’-CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述兩端固定序列為PCR擴增引物結合區。

1）將0.5ml (1x10⁹ 微粒) Invitrogen公司的帶有活化氨基的微磁珠與1 mol/L胰島素在偶聯緩沖液（20mM 磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M NaCl, 1mM DTT, pH 5.5）中混合，加入200ul偶聯劑溶液 [57% 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)]，將上述反應置于25oC條件下輕混24小時。將藕連胰島素的磁珠用磁珠分離裝置和清洗液（PBS，1mM DTT， 批H7.3）清洗后，重新懸浮于0.5ml PBS中。

2）將5nmol單鏈DNA文庫溶于結合緩沖液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, 1 mM CaCl2,0.02% Tween 20, 1 mM DTT），進行加熱處理：90 oC加熱10min，置于冰上10min，然后溫度放置5min。

3）將處理好的單鏈DNA文庫與結合有類胰島素的微磁珠孵育后，收集不結合磁珠的液體。

4）將步驟3）收集的液體與25ul步驟1）得到的胰島素-磁珠一起在結合緩沖液中37oC溫育30min。

5）用結合緩沖液洗滌溫育后的磁珠，然后加入200ul洗脫緩沖液（20 mM Tris-HCl pH7.6, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA），92oC孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液，進行PCR反應。

6）PCR反應程序為： 94oC預變性5 min; 94oC 30s，47oC 1min，72oC 1min, 擴增20個循環；最終延伸反應為72oC 10min。

7）PCR產物為5’端帶有生物素標記的雙鏈DNA，將產物與鏈霉親和素磁珠混合，25oC孵育30min后，用0.15 mol/L NaOH使雙鏈DNA變性為單鏈DNA，通過脫鹽柱純化即得到下一輪篩選的單鏈DNA文庫。

8）使用200pmol步驟7）得到的新單鏈DNA文庫，重復進行步驟2）至步驟8）的篩選程序，共進行15輪篩選。最后克隆并測序第15輪單鏈DNA文庫，得到INS5核酸序列：taggcctcgg acgttatata cacgatctct acgaccgttc tggctgcgtt tcggactgt。

實施例2 以流式分析法檢測核酸適體INS5與胰島素的結合能力

1）合成5’端帶熒光基團FAM標記的胰島素核酸適體。

2）使用0 nml/L, 5 nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, 100 nml/L, 200 nml/L濃度梯度的FAM標記的核酸適體連接胰島素(INS)的微磁珠來測定胰島素核酸適體的解離常數（kd）。用200μL結合緩沖液稀釋的上述各種濃度核酸適體，加入150 nmol/L連接胰島素的微磁珠, 37oC溫育30min。用結合緩沖液洗滌磁珠后，重新懸浮在250μL結合緩沖液中。設置隨機序列的寡核苷酸片段和連接類胰島素(IN)的微磁珠作為對照。類胰島素為人工合成的胰島素類似物（地特胰島素）。

3）使用BD公司的流式細胞儀對微珠進行熒光測定，然后用Sigma plot軟件作圖，計算出所篩選到的核酸適體與胰島素相互作用的解離常數（kd）相對值，結果如圖1所示。

序列表

<110> 柳州立潔科技有限公司

<120> 胰島素核酸適體INS5及其制備方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taggcctcgg acgttatata cacgatctct acgaccgttc tggctgcgtt tcggactgt 58