本發明屬于農業微生物及基因工程
技術領域：
：，涉及一種利用水稻白葉枯病菌Ⅲ型分泌系統轉運目標蛋白到植物體內的表達載體及其應用。
背景技術：
：：許多植物和動物病原菌都配備有效應蛋白(translocatedeffectorproteins)作為其“分子兵工廠”，效應蛋白能幫助病原菌感染宿主并在宿主中定殖。效應蛋白對于病原菌在植物/動物中的增殖和侵染具有極其重要的作用。隨著各種病原菌(細菌、真菌等)基因組測序的完成，本領域技術人員通過生物信息學分析預測了數目龐大的分泌型蛋白質。但生物信息學僅能對蛋白質的功能進行預測，預測結果的準確性無法確保，因此蛋白質是否真的具有預測的功能，仍然需要試驗驗證。很多病原菌分泌蛋白的含量很低且分泌方式不明確，很多寄生性真菌無法在人工培養基上培養，也沒有辦法進行遺傳操作，因此研究這些病菌侵染時所分泌蛋白的功能非常困難。如何從數目龐大的預測蛋白中快速有效的篩選出對致病菌存在重要作用的效應蛋白就變得極其有意義。技術實現要素：本發明的目的是提供一種利用水稻白葉枯病菌Ⅲ型分泌系統轉運目標蛋白到植物體內的表達載體及其應用。本發明首先保護一種特異DNA分子，自上游至下游依次包括如下區段：區段甲、區段乙和區段丙；所述區段甲為HrcC啟動子；所述區段乙為TAL信號肽；所述區段丙為轉錄終止序列。所述區段甲具體可如序列表的序列1第7-524位核苷酸所示。所述區段乙具體可如序列表的序列1第525-674位核苷酸所示。HrcC啟動子和TAL信號肽的物種來源均為XOO生理小種PX099。所述特異DNA分子中，所述區段乙和區段丙之間還具有限制性內切酶的識別序列。所述限制性內切酶具體可為限制性內切酶SacⅠ。所述轉錄終止序列具體可為NOS轉錄終止序列。所述區段丙具體可如序列表的序列1第690-965位核苷酸所示。所述特異DNA分子具體可為如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1第7-965位核苷酸所示的DNA分子；(a2)序列表的序列1所示的DNA分子。含有以上任一所述特異DNA分子的重組載體也屬于本發明的保護范圍。所述重組載體具體可為在出發載體中插入以上任一所述特異DNA分子得到的重組載體。所述出發載體具體可為PUFR034載體。所述重組載體具體可為在PUFR034載體的EcoRI和KpnI酶切位點之間插入序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒。本發明還保護以上任一所述特異DNA分子的應用，為表達目的蛋白并將其轉運至植物細胞。所述目的蛋白具體可為mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具體可為序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具體可為序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質。所述avrxa10蛋白具體可為序列表的序列4所示DNA分子編碼的蛋白質。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述應用中，所述特異DNA分子借助水稻白葉枯病菌導入植物。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發明還保護以上任一所述重組載體的應用，為表達目的蛋白并將其轉運至植物細胞。所述目的蛋白具體可為mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具體可為序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具體可為序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質。所述avrxa10蛋白具體可為序列表的序列4所示DNA分子編碼的蛋白質。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述應用中，所述重組載體借助水稻白葉枯病菌導入植物。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發明還保護以上任一所述特異DNA分子的應用，為鑒定待測蛋白是否為效應蛋白。本發明還保護以上任一所述重組載體的應用，為鑒定待測蛋白是否為效應蛋白。本發明還保護一種鑒定待測蛋白是否為效應蛋白的方法，包括如下步驟：(1)將待測蛋白的編碼基因插入以上任一所述重組載體的所述區段乙和所述區段丙之間且所述編碼基因與所述區段乙位于同一個編碼框，得到重組質粒；(2)將步驟(1)得到的重組質粒導入出發菌，得到重組菌；所述初發菌為水稻白葉枯病菌；(3)分組操作如下：實驗組：將所述重組菌導入植物，然后觀察植物發病情況；對照組：將所述出發菌導入植物，然后觀察植物發病情況；在平行操作的前提下，如果實驗組植物的發病程度不同于對照組植物，待測蛋白為效應蛋白。所述效應蛋白為具有改變植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白質。所述改變具體可為促進。“實驗組植物的發病程度不同于對照組植物”具體可為“實驗組植物的發病程度高于對照組植物”。步驟(1)中，所述待測蛋白的編碼基因具體可通過重組插入所述重組載體的所述區段乙和所述區段丙之間。步驟(1)中，“將待測蛋白的編碼基因插入以上任一所述重組載體的所述區段乙和所述區段丙之間”的實現方式具體如下：①用限制性內切酶SacⅠ酶切所述重組載體，回收線性化載體；②在待測蛋白的編碼基因的5’末端增加片段甲(片段甲具體可為如下序列：CGGACGATGTCCGAGCTC)、3’末端增加片段乙(片段乙具體可為如下序列的反向互補序列：ACGATCTGCAGCGAGCTC)；所述片段甲由15-20個核苷酸組成，末尾的6個核苷酸為限制性內切酶SacⅠ的識別序列；所述片段乙由15-20個核苷酸組成，起始的6個核苷酸為限制性內切酶SacⅠ的識別序列；③取步驟①得到的線性化載體和步驟②得到的DNA分子，采用IIOneStepCloningKit進行重組操作，得到所述重組質粒。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。所述方法中，具體可將所述重組菌或所述出發菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中。所述方法中，實驗組具體可將所述重組菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中，對照組具體可將所述出發菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中，7天后觀察植物發病情況。所述菌懸液具體可為OD600nm＝0.5的菌懸液。所述菌懸液的具體制備方法可為：用10mM的MgCl2水溶液重懸所述重組菌或所述出發菌。本發明還保護一種鑒定待測蛋白是否為效應蛋白的試劑盒，包括以上任一所述重組載體和水稻白葉枯病菌。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發明提供的載體，借助Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)的Ⅲ型分泌系統將待測蛋白質強制分泌到植物體內。本發明提供了一種簡單易行且可批量操作的方法，該方法可將分泌蛋白強制分泌到植物體內，從而篩選出有重大生物學意義的效應蛋白。該發明對于植物病原菌致病機制的研究起到了一定的促進作用。附圖說明圖1為實施例2的結果。圖2為實施例3的結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。水稻白葉枯病菌即Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)。PUFR034載體：參考文獻：RobertDeFeyter,ClarenceI.KadobandDeanW.Gabriel；Small,stableshuttlevectorsforuseinXanthomonas；Gene,88(1990)65-72。IIOneStepCloningKit：Vazyme公司。實施例1、重組質粒pLCS的制備1、合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子中，包括如下區段(5’→3’)：區段甲：第7-524位核苷酸為區段甲；區段甲為啟動子區域(HrcCpromoter)，其功能為啟動外源基因強制表達；第433-458位核苷酸為PIP-box位點，其功能為是促進植物細胞壁溶解從而使Ⅲ型分泌系統發揮作用；區段乙：第525-674位核苷酸為區段乙；區段乙為信號肽區域(TALsignalpeptide)，其功能為促使蛋白質向分泌通路轉移；區段丙：第690-965位核苷酸為區段丙；區段丙為終止子區域(NOS轉錄終止序列)。序列表的序列1中，第675-680位核苷酸為限制性內切酶SacⅠ的酶切識別序列。Hrccpromoter和TALsignalpeptide的物種來源均為XOO生理小種PX099。2、用限制性內切酶EcoRI和KpnI雙酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產物。3、用限制性內切酶EcoRI和KpnI雙酶切PUFR034載體，回收約8.7kb的載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pLCS。經測序，對重組質粒pLCS進行結構描述如下：在PUFR034載體的EcoRI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。實施例2、驗證重組質粒pLCS對目的蛋白的表達和轉運效果1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列2中，第1-708位核苷酸編碼mCherry蛋白(紅色熒光蛋白)，第733-753位核苷酸編碼SV40NLS，第757-777位核苷酸編碼SV40NLS，第781-801位核苷酸編碼SV40NLS。SV40NLS即核定位信號。2、以步驟1合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。F1：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；R1：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCTTAAGATCCTACCTTTCTCT-3’。3、取重組質粒pLCS，采用限制性內切酶SacⅠ進行酶切，得到線性化質粒。4、取步驟2得到的PCR擴增產物和步驟3得到的線性化質粒，采用IIOneStepCloningKit并按試劑盒說明書進行重組操作，得到具有序列表的序列3所示DNA分子的重組質粒(命名為重組質粒甲)。5、將重組質粒甲導入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌。6、用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌，得到OD600nm＝0.5的菌懸液。7、取5葉1心的日本晴水稻，剝取倒數第二層的葉鞘，把步驟6得到的菌懸液注射到葉鞘中，3天之后觀察。結果見圖1。圖1中，左上圖為普通視野下，右上圖為觀察DAPI染色的視野下(DAPI對細胞核染色)，左下圖為觀察紅色熒光的視野下，右下圖為右上圖和左下圖的疊加圖。結果顯示，在水稻葉鞘細胞核中觀察到紅色熒光蛋白，說明重組質粒pLCS可以有效地表達目的蛋白并且將目的蛋白轉運至植物細胞內。實施例3、檢測待測蛋白是否為效應蛋白1、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列4所示的DNA分子編碼avrxa10蛋白。avrxa10蛋白為已知的效應蛋白(具有促進植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白質)。2、以步驟1合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。F2：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCatggatcccattcgttcgcg-3’；R2：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCtcagatcgtccctccgactg-3’。3、取重組質粒pLCS，采用限制性內切酶SacⅠ進行酶切，得到線性化質粒。4、取步驟2得到的PCR擴增產物和步驟3得到的線性化質粒，采用IIOneStepCloningKit并按試劑盒說明書進行重組操作，得到具有序列表的序列5所示DNA分子的重組質粒(命名為重組質粒乙)。5、將重組質粒乙導入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌甲。將重組質粒pLCS導入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌乙。6、用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌甲，得到OD600nm＝0.5的菌懸液甲。用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌乙，得到OD600nm＝0.5的菌懸液乙。7、進行如下平行處理：實驗組：取5葉1心的日本晴水稻，把菌懸液甲注射到寬度為5mm的葉片中(每株水稻注射1個葉片，注射量為20微升)，7天之后觀察發病表型。對照組：取5葉1心的日本晴水稻，把菌懸液乙注射到寬度為5mm的葉片中(每株水稻注射1個葉片，注射量為20微升)，7天之后觀察發病表型。完成上述操作了，試驗組葉片和對照組的葉片照片見圖2。與對照組葉片相比，實驗組葉片的發病表型更加嚴重，表明序列表的序列4所示的DNA分子編碼的avrxa10蛋白為具有促進植物病原菌侵染宿主植物的功能的效應蛋白。進行10次重復試驗，結果一致。當前第1頁1 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