一種用于檢測宮頸癌的引物組及檢測方法與流程

本發明涉及腫瘤基因領域，具體涉及一種用于檢測宮頸癌的引物組及檢測方法。
背景技術：
：宮頸癌是是全世界第三大常見惡性腫瘤，在女性常見腫瘤中，宮頸癌發病率位居第二位，僅次于乳腺癌。每年宮頸癌新發病例數約為50萬。現已明確，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染是宮頸癌主要的致病原因。其中HPV16，HPV18是最常見的亞型，在所有陽性的宮頸癌標本中二者共占98％。研究發現，病人的診斷年齡、疾病程度以及分型都影響了宮頸癌的治療效果。宮頸癌具有很強的異質性，可在不經治療的情況下自行消退，也可表現極具侵襲的惡性表型，對多種治療手段沒有反應而迅速惡化，因此對宮頸癌的早期診斷十分必要。目前宮頸癌的診斷方法包括影像學檢查，細胞病理學和組織病理學診斷，影像學檢查包括X射線、CT掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測準確度不高。通常的細胞和組織病理學檢測包括細胞活檢，如巴氏涂片細胞學技術在過去的五十年里已廣泛地應用于宮頸癌篩查，然而該方法需要通過外科手術或者穿刺的方法從患者上獲取組織的檢材，不但不方便，而且會對患者造成人體傷害。近來，循環腫瘤細胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者術后復發和遠處轉移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學標本如骨髓等相比，外周血標本容易獲取，且對患者創傷小，是臨床上常規檢測較為理想的標本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發現疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負選。正選主要是通過CTC表面標志物或細胞的物理性質(大小、密度)進行捕獲；前者是基于免疫磁球技術和微流控芯片技術，后者是基于過濾、離心的原理。負選則是通過白細胞表面標志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴重依賴于腫瘤細胞表面標記物的表達，因此無法捕獲未表達表面腫瘤標記物的CTC細胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細胞的特異性基因是CTC細胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費用低，敏感度高，而且容易自動化。目前采用RT-PCR方法檢測卵巢癌CTCs的標準還沒有完全建立。我們通過檢測宮頸癌患者的CTCs特征基因，確定宮頸癌CTCs的檢測方法和檢測標準。這些檢測方法和標準的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物，包括NK和CAR-T免疫治療的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本發明開發一種高靈敏的多基因聯合檢測方法，通過聯合檢測EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18九個基因實現腫瘤的早期檢測。本發明設計和運用靶特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達到95％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。技術實現要素：本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于檢測宮頸癌的引物組及檢測方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種用于檢測宮頸癌的引物組，包含：本發明的引物組可通過以下兩種方法實現宮頸癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應的每個循環的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進行反轉錄和PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應的每個循環的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環；每管設立三個復孔；(2)進行反轉錄和PCR反應，并實時檢測熒光；(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值，判斷是否有標志物靶基因表達于樣品中。本發明的有益效果在于：本發明通過設計特異性PCR引物，開發出用于宮頸癌早期檢測的多基因聯合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18基因進行聯合檢測；(2)通過同時對多個基因進行檢測宮頸癌檢出率可達到95％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達水平均可檢出；(4)特異性強，正常人或非宮頸癌病人樣本不會產生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費用低廉。附圖說明圖1為實施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實施例中非宮頸癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實施例中非宮頸癌組織樣本檢測陰性PCR圖。圖4為實施例中宮頸癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實施例中宮頸癌患者腫瘤組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M；2.EPCAM；3.CK19；4.CK20；5.MUC1；6.EGFR；7.CEA；8.C-Met；9.HPV16；10.HPV18。具體實施方式本發明針對目前宮頸癌中的腫瘤驅動基因，通過聯合檢測EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18九個基因實現宮頸癌的早期檢測。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。針對上述問題，設計出用于檢測上述九個基因的一整套特異性引物組。根據上述2個基因的參考序列設計特異性擴增引物，其PCR產物長度最優是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設計軟件的要求。通過采用實時熒光PCR反應檢測體系，實現多個基因聯合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。其中，所用的(帶標記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1:基因選擇多項研究表明，單基因篩查敏感度約為20-40％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準確度。ClaudiaPfitzner等人(ClaudiaPfitzner,CorneliaScheungraber,etal.Digital-Direct-RT-PCR:asensitiveandspecificmethodforquantificationofCTCinpatientswithcervicalcarcinoma.SCIENTIFICREPORTS,4:3970,DOI:10.1038.)同時檢測HPV16、HPV18基因，結果表明聯合檢測兩個基因用于宮頸癌早期診斷的敏感度為68％，準確率達72.3％。我們通過基因篩選發現56個基因在宮頸癌中表達量升高。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預后，我們對宮頸癌和正常組織的差異表達基因進行了篩選。我們通過大量比對實驗發現CK7、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、VEGF和VEGFR2組成的基因組對宮頸癌具有較高的檢出率，達到98％，相對于現有的檢測技術，產生了意想不到的技術效果，具有顯著的進步。實施例2:引物篩選(1)設計引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學軟件對靶基因A-I序列進行分析，利用序列分析軟件設計特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設計出3對特異性擴增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3。表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理收集某醫院收治并經病理證實的宮頸癌患者外周血，清晨7點，空腹，經肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4hr。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2向保留液體中，加入等體積氯化銨紅細胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準確測得樣品RNA濃度；4.2嚴格按照cDNA反轉錄試劑盒說明書在冰上制備反轉錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應體系，并利用離心機短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴增用TaqDNA聚合酶配置反應體系，用引物為a-i和人內參基因(B2M)進行PCR擴增各樣品，產物用1％凝膠檢測；擴增體系PCR反應條件是95℃預變性3分鐘，1個循環；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個循環；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實時定量PCR擴增根據設計的特異引組a-i，通過熒光定量PCR進行擴增，體系如下：成分體積2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃預變性20s，1個循環；95℃10s，60℃30s，40個循環；每管設立三個復孔；根據步驟5和6的PCR結果，篩選出以下引物組，作為本發明用于檢測宮頸癌的引物組。實施例3：效果驗證根據實施例2的篩選結果，采用下表所述的引物組對100個腫瘤樣本進行檢測。其中，CK8的正向引物為CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物為GTTGGCAATATCCTCGTACT；CK18的正向引物為GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物為CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；N-cadherin的正向引物為CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物為CAGACCTGATCCTGACAAGC；VEGF的正向引物為GTGCCCGCTGCTGTCTAATG；反向引物為CACATCTGCAAGTACGTTCG。1～9號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進一步地，通過比較5～9號引物組可以發現，引物組內的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時在相同的檢測基因數量情況下，5號引物組的檢出率高于6～9號引物組。因此，我們優選5號引物組的基因組合用于宮頸癌的檢測。進一步通過研究發現，5號引物組中，EPCAM、CK19、CK20的表達可提示上皮細胞來源的腫瘤；表皮生長因子受體(EGFR)在眾多惡性腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用，成為目前腫瘤研究新熱點之一；c-Met作為受體酪氨酸激酶與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移和凋亡相關；MUC1在腫瘤組織中多出現異常表達，在炎癥和腫瘤的進展中起著重要的作用；CEA是一種廣譜腫瘤標志物。由上可知，本發明并不是將9對引物進行簡單疊加組合，9對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術效果。綜上所述，本發明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出宮頸癌的細胞生物學特征。實施例4：特異性分析根據實施例2的篩選結果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本(圖1)、非宮頸癌病人的外周血(圖2)、非宮頸癌病人的癌組織樣本(圖3)、宮頸癌病人的外周血樣本(圖4)和組織樣本(圖5)進行檢測。結果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非宮頸癌病人的外周血樣本(圖2)及組織樣本(圖3)中均未檢測到基因的表達，而在宮頸癌病人的外周血和腫瘤組織樣本中可檢測到多個基因的表達，分別為7/9和9/9，說明本發明中所述引物組具有高度的特異性。當前第1頁1 2 3