一種產順式?4?羥脯氨酸的方法與流程

技術領域

本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種產順式-4-羥脯氨酸的方法。

背景技術：

羥脯氨酸（hydroxyproline），亞氨基酸之一，通常在第四位上帶有羥基，但有時也在第3位上。由于有兩個不對稱的碳原子，所以有4種立體異構體。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸。自然界中不存在D-羥脯酸。是生物體內廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，可以通過脯氨酸羥化酶生成。在食品、醫學和工業上具有廣泛的應用。在食品上, 羥脯氨酸可作為嬰兒的營養物質來源來補充甘氨酸丙氨酸和葡萄糖，羥脯氨酸還有獨特的甜味能改善飲料的風味，常作為飲料的添加劑；醫學上，在食品和飲料中添加可防止過敏性炎癥，衍生物 N-乙酰羥脯氨酸可用于治療結蹄組織疾病和風濕性關節炎；順式-4-羥脯氨酸作為抗癌藥物治療各種癌癥，包括肝，膀胱，前列腺，腎盂等。防止骨膠原折疊成一個穩定的三螺旋構象,從而減少瘤細胞生長和纖維化過程中膠原過度沉積；抗肝纖維化、抗高血壓。

隨著經濟快速發展，大氣污染和全球變暖的趨勢日益惡化。國內多采用生物提取法由明膠、骨膠、干酪素、大豆表皮等蛋白質，用鹽酸水解，用亞硝化法提取亞氨酸后經樹脂層析后精制、結晶而成，并且順式-4-羥脯氨酸的生產還需要通過手性異構合成，生物法合成順式-4-羥脯氨酸具有經濟學和生態學雙重意義，生物法合成順式-4-羥脯氨酸的基因工程菌主要有大腸桿菌和酵母。目前生物法合成順式-4-羥脯氨酸主要有兩種方式：發酵法和生物轉化法。發酵法原料來源廣泛且可再生，成本低，產量較高，污染也較小，但其調控過程比較復雜；生物轉化法產量高，成本低，過程簡單，有利于下游提取操作。大腸桿菌生長速率快，生產周期短，而大腸桿菌中存在底物降解途徑與羥脯氨酸產生存在競爭，而羥脯氨酸的產生需要α-酮戊二酸參加反應，而α-酮戊二酸也存在其他途徑的競爭，然而敲除過多基因會抑制菌體的生長，本文通過CASI抑制putA脯氨酸脫氫酶基因，以及琥珀酸脫氫酶sucA，sucB,異檸檬酸裂解酶基因aceA,異檸檬酸激酶aceK的表達提高反應中α-酮戊二酸和脯氨酸濃度利于順式-4-羥脯氨酸的產生。

技術實現要素：

為解決現有技術問題，本發明的目的是提供一種產順式-4-羥脯氨酸的方法，該方法簡單易行，提高了原料利用率，節約了生產成本，該方法能利用脯氨酸產生順式-4-羥脯氨酸即解決了生產過程中的環境污染問題，又解決了敲除多個基因會影響菌體的快速生長，又能提高底物與輔酶濃度提高產物的產生。

一種產順式-4-羥脯氨酸的方法，通過在宿主菌細胞內構建過表達脯氨酸羥化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9技術抑制脯氨酸降解途徑中脯氨酸羥化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途徑中琥珀酸脫氫酶基因sucA、sucB，異檸檬酸裂解酶基因aceA和異檸檬酸激酶基因aceK的表達得到重組菌株，并將重組菌株發酵培養后獲取全細胞，最后全細胞轉化生產順式-4-羥脯氨酸。

作為上述方法優選的是，所述脯氨酸羥化酶基因putA，GenBank: AY143338.1 ；琥珀酸脫氫酶sucA和sucB,Gene ID: 7329904；異檸檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829；異檸檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。

作為上述方法優選的是，所述的宿主菌為大腸桿菌BL21、大腸桿菌TransB、大腸桿菌Rosetta或大腸桿菌Origami中的一種。

上述方法包括以下步驟：

步驟1，配種子培養基、發酵培養基、反應液、soc培養基、菌體洗液，并與培養皿、錐形瓶、離心管滅菌后備用；

步驟2，構建得重組質粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并轉入宿主菌細胞內37℃下培養12-14h得菌種；

步驟3，向離心管中依次接入種子培養基和菌種后，搖床上培養9-10h得發酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中依次接入發酵培養基和發酵菌種，搖床培養至OD至少為0.6，再加入至終濃度為0.8-1.2mmol的IPTG，誘導培養后離心8-10min，倒掉上清，收集菌體，用菌體洗液洗滌2-4遍后得備用菌體；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應液和備用菌體，加入緩沖溶液，并用KOH調節pH至中性，進行全細胞催化反應，反應中并用磷酸調節pH至中興，其中，備用菌體的干重為0.41g/L；

步驟6，每隔5-8h取樣一次，并通過液相檢測產物，待全細胞催化55-65h時結束得產物順式-4-羥脯氨酸。

作為方法優選的是，步驟1中反應液由脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亞鐵和維生素C組成，其中，脯氨酸密度為9-11g/L， α-酮戊二酸密度為10-12g/L，硫酸亞鐵和維生素C的摩爾濃度比為3：4mmol/L。

作為方法優選的是，步驟3中搖床培養溫度為37℃，轉速為250rpm。

作為上述方法優選的是，步驟4中發酵培養基與搖瓶體積比為1：5，發酵菌種的量為發酵培養基的1-2%倍，搖床轉速為200rpm，誘導培養的溫度為20℃，轉速為200rpm，離心用的離心力為4000g/min，離心10min。

作為上述方法優選的是，步驟5中pH調節至6-8。

作為pH優選的是，步驟5中pH通過磷酸調節至6.5。

作為上述方法優選的是，步驟6中全細胞催化時間為60h。

有益效果

本發明方法提供了一種產順式-4-羥脯氨酸的方法，有效降低了胞內脯氨酸在其他路徑上的消耗，首次實現了用CASI系統減少了脯氨酸用于其他路徑的消耗，并且抑制了降解α-酮戊二酸的競爭途徑抑制了多個基因，但不影響菌體的生長，使得一種產順式-4-羥脯氨酸的方法變得更加簡單，不僅有效的減少了底物脯氨酸和α-酮戊二酸的消耗，而且大幅度提高了轉化效率。這從很大程度上節約了生產成本，并對于環境的保護起到了一定的作用。

（1）有效降低了胞內脯氨酸在其他路徑上的消耗的培養策略，增加了CASI

抑制比不增加CASI抑制產量提高了1.5倍，效果明顯。

（2）抑制了降解α-酮戊二酸的競爭，降低了反應成本，并且不影響菌體的

生長，有利于工業化生產。

附圖說明

圖1為標準品順式-4-羥脯氨酸的出峰時間4.1分鐘；

圖2為標準品底物L-脯氨酸的出峰時間8.1分鐘；

圖3為實施例2中順式-4-羥脯氨酸的出峰時間及底物L-脯氨酸的出峰時間；

圖4 為重組質粒pET-28a-CP4H；

圖5 為重組質粒pACYC-Cas9；

圖6 為重組質粒pCDF-303-putA-aceA-aceK-sucA-sucB。

具體實施方式

實施例1 構建重組質粒

1.通過金唯質基因合成公司合成優化后脯氨酸羥化酶基因構建于在體pET-28a載體上酶切位點為NdeI/XhoI. 構建得重組質粒pET-28a-Ecp4H

2.pACYC-CAS9蛋白為實驗室提供

3.pCDF-303-CriRNA-putA-sucA-sucB-aceA-aceK

抑制代謝途徑脯氨酸降解基因putA,琥珀酸脫氫酶基因sucA和sucB,異檸檬酸裂解酶基因aceA,異檸檬酸激酶aceK，轉化pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質粒pCDF-putA-sucA-sucB-aceA-aceK。

實施例2

一種產順式-4-羥脯氨酸的方法，包括以下步驟：

步驟1，配種子培養基、發酵培養基、反應液、soc培養基、菌體洗液，并與培養基、錐形瓶、離心管一起滅菌備用，其中：

發酵培養基LB：蛋白胨10g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，氨芐青霉素0.02%，氯霉素0.01%，鏈霉素0.01% pH7.0。

反應液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/L磷酸二氫鉀, 0.2mol/L磷酸氫二鉀,0.8mmol/L維生素C, 0.4 mmol/L 硫酸亞鐵，其中硫酸亞鐵用純水配置。

菌體洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH₂PO_{4 ,}2.96g/LNa₂HPO₄。

soc培養基:蛋白胨4g/L，酵母粉1g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO₄ 10mm/L，MgCl₂ 20mm/L，葡萄糖20 g/L。

種子培養基的配方同發酵培養基。

步驟2，將實施例1中構建得重組質粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，轉入大腸桿菌TransB后在37℃的培養箱中培養12-14h得菌種；

步驟3，向50ml離心管依次接入10ml的種子培養基、0.2um的抗生素和菌種后，搖床37℃轉速為200rpm下培養得發酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中依次接入發酵培養基和發酵菌種，搖床培養至OD長至0.6時，加入至終濃度為1mmol的IPTG，20℃，200rpm誘導12h后，離心10 分鐘倒掉上清，收集菌體后用菌體洗液2遍后得備用菌體，其中離心時離心力4000g/min；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應液和備用菌體，控制反應溶液中菌體的干重為0.41g/L，加入緩沖溶液，并用KOH調節pH至7.2后進行全細胞催化反應，反應過程中用磷酸調節pH在7.2。

步驟6，每隔6h取一次樣檢測，并通過液相檢測產物，等到55h-65h停止催化反應，取最終產物。

順式-4-羥脯氨酸含量，HPLC-ELSD分析。

HPLC-ELSD分析使用蒸發光檢測器，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC條件為：流動相A：1升純水中含有7毫升三氟乙酸0.653毫升七氟丁酸，流動相B：100% 乙腈，條件如下：100% A；流速：1.0 ml/min；柱溫：28.5±1 °C；進樣量：10 μl。ELSD檢測條件：霧化溫度為115°C，氣流速為3.2L/min。

轉化產物經HPLC-ELSD分析（如圖3所示），出峰時間為4.1分鐘與標品出峰時間一致。

實施例3

一種產順式-4-羥脯氨酸的方法，包括以下步驟：

步驟1，配種子培養基、發酵培養基、反應液、soc培養基、菌體洗液，并與培養皿、離心管滅菌備用，其中：

soc培養基:蛋白胨4g/L，酵母粉1 g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO4 10mm/L，MgCl2 20mm/L，葡萄糖20 g/L。

發酵培養基M9：葡萄糖10g/L，NH4Cl 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 1mol/L,CaCl2 1mol/L,FeSO4?7H2O 0.005mol/L；

反應液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/LKH2PO4, 0.2mol/LK2HPO4,0.8mmol /L維生素C, 0.4 mmol /L FeSO4，其中硫酸亞鐵用純水配置；

菌體洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。

步驟2至步驟3同實施例。

步驟4，向錐形瓶中依次接入發酵培養基和發酵菌種，搖床培養至OD為0.6時，加入至終濃度為1mmol的IPTG，20℃，200rpm誘導14h后，離心10 分鐘，倒掉上清，收集菌體，用菌體洗液清洗2遍后得備用菌體，其中離心時離心力4000g/min。

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應液和備用菌體，控制反應溶液中菌體的干重為0.41g/L，加入緩沖溶液，并用KOH調節pH至6.5后進行全細胞催化反應，反應過程中用磷酸調節pH在6.5。

步驟6，每隔6h取一次樣檢測，并通過液相檢測產物，等到55h-65h取產物順式-4-羥脯氨酸。

對比例

以上述產脯氨酸羥化酶菌株進行全細胞催化，其他反應條件同實施例2，全細胞催化結束后轉化液中順式-4-羥脯氨酸產量達到2.50g/L。

本發明方法中不同實施例產順式-4-羥脯氨酸的量記錄于下表中，從中可以看出由于pH的改變導致產量發生明顯的變化，及由于M9培養基比較簡單，所以菌體生長慢一些，但成本比較低。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制；凡本領域的技術人員，應該理解，上述實施例和說明書中描述的只是說明發明的原理，在不脫離本發明技術精神和范圍的前提下，本發明還會有些許更動、修飾與演變的等同變化，凡依據本發明的實質技術對以上實施例所做的任何等同變化的更動、修飾與演變等，均應包含在本發明的保護范圍內。