用于皮膚護理中的穩定化蛋白酶的制作方法

優先權本申請要求2010年1月19日提交的美國臨時申請No.61/296,052的優先權。概述公開了一項發明，其涉及合成用作皮膚護理劑的源自植物的固定化和交聯的蛋白酶。所得到的穩定化蛋白酶將因為其固定化性質而最少限度地滲透皮膚。該蛋白酶將因其交聯性質并且在某些實施方案中歸因于其借助物理添加劑的穩定作用而保留活性。本發明尤其涉及在局部皮膚應用中使用的連接的木瓜蛋白酶產物。背景蛋白酶的活性在表皮穩態方面是重要的。因此，當施加至皮膚時，蛋白酶具有多種潛在益處，但是受某些限制作用影響。木瓜蛋白酶是一種源自番木瓜和某些其他植物的有力蛋白酶。然而，它在溶液狀態下迅速喪失活性。這是因為與全部蛋白酶相似，木瓜蛋白酶自我消化以及經歷變性。此外，當使用常規木瓜蛋白酶產物作為與皮膚滲透和皮膚刺激相關的局部皮膚護理劑時，可以遭遇伴隨這些木瓜蛋白酶產物的其他難題。高度地希望的是開發在皮膚護理中使用的沒有此類限制的蛋白酶產物，并且更具體地，木瓜蛋白酶產物。為克服常規技術中的上述難題，本發明的示例性實施方案提供借助本文所述的技術改良的穩定的交聯蛋白酶產物，并且尤其提供改良的穩定的交聯蛋白酶產物。例如，在本發明的一些實施方案中，為了獲得穩定的交聯木瓜蛋白酶產物、將木瓜蛋白酶在初級交聯反應中固定在聚合物如例如卡波姆或卡波普上，并且隨后通過添加具有胺反應性的低分子量同源雙功能交聯試劑(例如己二亞氨酸二甲酯(DMA,Dimethyladipimidate)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯(BS3,Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate)、辛二亞氨酸二甲酯(DMS,DimethylSuberimidate)、庚二亞氨酸二甲酯(DMP,Dimethylpimelimidate)和辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS,Disuccinimidylsuberate))進行二級交聯反應。在本發明的其他示例性實施方案中，進行初級交聯反應和二級交聯反應以獲得穩定的交聯木瓜蛋白酶產物，并且隨后穩定的交聯木瓜蛋白酶使用物理穩定劑例如糖或糖聚合物進一步穩定。例如，藻酸鈉可以根據本發明的示例性實施方案用作物理穩定劑。以上交聯的穩定化木瓜蛋白酶產物仍可以通過包括在某些防腐劑體系或水包油制劑中的以上穩定化木瓜蛋白酶產物被進一步穩定化。根據本發明的示例性實施方案的固定化、交聯和穩定化蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)復合物的益處包括但不限于：1.最小的皮膚滲透作用，2.在溶液中或干燥形式下保留蛋白酶活性3.最小的皮膚刺激作用，和4.易于配制。在本發明的其他實施方案中，描述了包含穩定化蛋白酶的化妝品組合物、個人護理組合物和藥物組合物。附圖簡述以下附圖僅出于說明目的而提供，并且不意圖是限制性的。圖1說明用于形成根據本發明的穩定的交聯蛋白酶的交聯反應。圖2說明根據本發明的示例性實施方案的穩定的交聯木瓜蛋白酶產物，所述產物已經歷過圖1中說明的交聯反應。圖3說明在多個溫度下貯存根據本發明的示例性實施方案的穩定化木瓜蛋白酶的樣品多達12周后第0天活性的百分比。圖4說明在多個溫度下貯存無DMA樣品多達12周后第0天活性的百分比。圖5說明Sigma木瓜蛋白酶標準曲線。圖6(a)說明根據本發明的示例性實施方案在多個溫度下貯存穩定化木瓜蛋白酶樣品多達12周后保留的第0天活性的百分比。圖6(b)說明在多個溫度下貯存無DMA樣品多達12周后保留的第0天活性的百分比。圖7是說明在根據本發明的示例性實施方案的穩定的交聯木瓜蛋白酶產物中不存在游離的活性木瓜蛋白酶的圖表。圖8是說明含有0.2％BS3的樣品和不含任何BS3的對照樣品在不同溫度下1周后的活性百分比的圖表。圖9是說明穩定化木瓜蛋白酶樣品在有和沒有0.1％藻酸鹽的情況下4周后的保留活性的百分比的圖表。圖10是Sigma木瓜蛋白酶標準曲線。圖11是說明糖或糖聚合物對在25℃和40℃下10天后的游離木瓜蛋白酶的穩定性的影響的圖表。圖12是說明0.4％木瓜蛋白酶在2周后保留的活性的百分比的圖表。圖13(a)說明已經由DMA交聯并且已經與藻酸鈉進一步反應的穩定的交聯木瓜蛋白酶產物。圖13(b)是說明在多個溫度下貯存1％DMA樣品多達12周后保留的活性的百分比的圖表。圖13(c)是說明在多個溫度下貯存無DMA樣品多達12周后第0天活性的百分比的圖表。圖14是說明DMA對連接的木瓜蛋白酶的活性保留的影響的曲線圖。圖15是說明在不同溫度下12周后的連接木瓜蛋白酶樣品中的活性的圖表。圖16是Sigma木瓜蛋白酶標準曲線。圖17是說明在制劑中保留的(含DMA的)連接木瓜蛋白酶的活性的曲線圖。圖18是說明在制劑中保留的(不含DMA的)連接木瓜蛋白酶的活性的曲線圖。圖19是說明在制劑內保留的連接木瓜蛋白酶的活性的曲線圖。圖20是在安慰劑制劑中的Sigma木瓜蛋白酶的標準曲線。圖21是說明在油和水制劑中保留的連接木瓜蛋白酶的活性的曲線圖。詳述除非另外限定，否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于實施或檢驗本發明，然而現在描述合適的方法和材料。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用方式完整地并入。在矛盾的情況下，本說明書(包括定義)將居主導。此外，所述材料、方法和實施例僅是說明性的并且不意圖是限制性的。本發明的其他特征和優點將從以下詳細描述并且從權利要求書中是顯而易見的。如對本領域技術人員而言將顯而易見的，本文所述的具體特征和實施方案可以與任何其他特征或實施方案組合。表皮由幾個層(strata)或層組成。最外層—角質層由死亡的細胞組成，所述細胞已經在幾天范圍內從該層下方向上移行。這些死亡細胞通常借助一個稱作表皮脫屑的過程從皮膚表面撒落，所述過程刺激新細胞在更深水平下生長。較年幼的皮膚在這個過程中比老化或受損的皮膚更高效。因此，老化的皮膚顯得晦暗、厚和較無光澤(lesstoned)。這可以因環境因素而惡化，如暴露于陽光；激素影響，如雄激素、雌激素和表皮生長因子；和維生素缺乏如維生素A和D的缺乏。蛋白酶活性是脫屑過程中的關鍵因素。因此，為化妝效果(如皮膚光滑和抗老化)施加蛋白酶至皮膚是合乎需要的。然而，蛋白酶在化妝品和其他應用中的用途已知具有三個主要限制：不穩定性、可能有變應原性和皮膚滲透作用。本發明基于，至少部分地基于這樣的發現：蛋白酶可以借助某些交聯反應來穩定以形成蛋白酶卡波姆共聚物，在本文也稱作“穩定化蛋白酶”。此類穩定化蛋白酶包含與卡波姆交聯的蛋白酶，其中蛋白酶的伯胺與卡波姆的羧基交聯并且其中蛋白酶的胺經胺反應性交聯試劑進一步交聯。在本發明的一個實施方案中，穩定化蛋白酶還包含物理穩定劑，例如糖或糖聚合物。還公開了一種形成此類穩定化蛋白酶產物的方法，其中進行初級交聯反應以將與所述蛋白酶的伯胺與卡波姆的羧基交聯并且通過胺反應性交聯試劑進行二級交聯反應。蛋白酶蛋白酶是催化蛋白質分解的酶。蛋白酶，本身作為蛋白質，具有自我降解的傾向并且在本質上是不穩定的。這種蛋白質本質也使得它們具有變應原性。另外，因為它們降解蛋白質的能力，所以它們可以滲透至表皮的更深層并且對下層造成損傷。用于本發明中的合適蛋白酶包括木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶和奇異果蛋白酶。無花果蛋白酶是從無花果(榕屬(Ficus)樹的果實)的膠乳中分離的非特異性巰基蛋白酶。無花果蛋白酶最常見地從無花果(Ficuscarica)和脫毛榕木(Ficusglabatra)獲得。然而，無花果蛋白酶也可以從其他榕屬物種(如印度榕(Ficuselastica)和Ficusinsipida)的果實中分離。菠蘿蛋白酶是從菠蘿(鳳梨(Ananascomosus))的莖和/或果實分離的巰基蛋白酶。奇異果蛋白酶，也稱獼猴桃蛋白酶，是一種從獼猴桃果實(硬毛獼猴桃(Actinidiadeliciosa))獲得的半胱氨酸蛋白酶。木瓜蛋白酶是一種從番木瓜(Carciapapaya)和山地番木瓜(Vasconcelleacundinamarcensis)、最經常地從綠色未成熟果實的膠乳中獲得的半胱氨酸蛋白酶。這些蛋白酶按重量計以約0.1％和5％之間的濃度存在。卡波姆蛋白酶首先固定在卡波姆上。卡波姆是具有高分子量的丙烯酸的均聚物，所述丙烯酸與幾種多元醇烯丙基醚(例如烯丙基醚季戊四醇、蔗糖的烯丙基醚或丙烯的烯丙基醚)中的任一種交聯。合適卡波姆的例子是卡波姆910、卡波姆934、卡波姆934p、卡波姆940和卡波姆941，其中數字后綴表示聚合物鏈的平均分子量。如本文所用，“固定化”蛋白酶或“連接的”蛋白酶指已經通過初級交聯反應與卡波姆反應的蛋白酶。適用于這種初級交聯反應的交聯劑是能夠將羧基與伯胺偶聯的試劑。合適交聯劑的一個例子是水溶性碳二亞胺1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺。EDC是用來將羧基與伯胺偶聯的零長度交聯劑。EDC與羧酸基團反應以產生O-酰基異脲基團，該基團與游離的胺基團反應后形成交聯鍵。EDC在這個實施方案中是在反應期間轉變成雙取代脲的初級交聯劑。NHS是一種增加交聯速率并且在交聯反應期間保持不變的酸酯和催化劑。化學交聯劑一旦固定在卡波姆上，則固定化蛋白酶與胺反應性交聯試劑在二級交聯反應中反應以形成蛋白酶卡波姆共聚物，在本文也稱作“穩定化蛋白酶”。交聯試劑優選地是低分子量交聯試劑，從而該交聯試劑將在二級交聯反應中完全反應或近乎完全反應。可以使用的合適交聯試劑的例子包括亞氨酯交聯試劑如己二亞氨酸二甲酯(DMA)、庚二亞氨酸二甲酯(DMP)、辛二亞氨酸二甲酯(DMS)和二甲基3,3二硫代雙(dimethyl3,3dithiobis)。胺反應性交聯試劑可以按重量計以范圍從約0.05％至約5％、優選地約1％和5％之間的多個濃度提供。在某些實施方案中，使用DMA。物理穩定劑在化學交聯后，固定化和交聯的蛋白酶任選地用物理穩定劑例如糖或糖聚合物進一步穩定。合適的糖或糖聚合物的例子是藻酸鈉、海藻糖、甘露醇、甘油和黃原膠。在一個實施方案中，使用藻酸鈉。這種物理穩定劑可以按重量計約0.1％和5％之間的濃度包含。在圖1中顯示用于形成本發明穩定化蛋白酶的一個實施方案的交聯反應的圖示。在圖2中顯示穩定化木瓜蛋白酶產物的圖示。應用/制劑本發明的穩定化蛋白酶具有最小的皮膚滲透作用，以溶液或干燥形式保留蛋白酶活性，具有最小的皮膚刺激作用并且相對易于在制劑中提供。因此，與常規技術的蛋白酶產物相比，本發明的示例性實施方案提供更穩定和安全得多的蛋白酶產物，特別是穩定化木瓜蛋白酶產物實施方案。穩定化蛋白酶適用于化妝品和個人護理制劑中，例如，剝脫制品、抗皺紋和/或抗老化制品、沐浴添加劑、護發制品、液體皂和銷售皂、清潔溶液、濕潤清潔布、油劑或粉劑、抗痤瘡制品。穩定化蛋白酶特別適于通過施加本發明的一種或多種穩定化蛋白酶至需要治療的干燥、老化或受損皮膚來治療干燥、老化或受損的皮膚。化妝品和/或個人護理制劑可以為例如油包水或水包油乳液、醇性或含醇制劑、離子型或非離子型兩性脂質的囊泡狀分散體或凝膠的形式。示例性化妝品和/或個人護理制劑包含按重量計約0.5％和5％之間、優選地約1％和3％之間的穩定化蛋白酶。本發明的穩定化蛋白酶也適于藥物應用，例如，清創應用。清創是從傷口(例如潰瘍傷口或燒傷)除去死亡或受損組織以輔助愈合。在本發明的一個實施方案中，將本發明的一種或多種穩定化蛋白酶施加至需要清創的皮膚傷口或燒傷。用于治療傷口或燒傷的包含穩定化蛋白酶的示例性制劑和產品包括繃帶/敷料、貼劑、洗滌溶液劑、油膏劑或凝膠劑或合成性組織。在某些實施方案中，清創組合物，例如繃帶、敷料或貼劑，可以任選地包括抗微生物藥。對于清創應用，在藥物組合物中包括的穩定化蛋白酶的量將是有效清除壞死組織和使傷口中的膿液化并且在合理時間內(例如，在七天時間內)實現基本上除去全部此類物質的量。除皮膚護理應用之外，本發明的穩定化蛋白酶也可以適于本領域已知的其中將希望有穩定形式蛋白酶的其他應用中。一個示例性應用是口腔護理組合物。包含穩定化蛋白酶的局部用組合物可以進一步包含在化妝品制劑、個人護理制劑或藥物制劑中常規使用的多種其他成分，只要它們沒有不可接受地更改本發明的益處。任選常規成分類別的非限制性例子包括香料、顏料、著色劑、精油、收斂劑、抗老化劑、抗痤瘡劑、抗結塊劑、消泡劑、抗微生物劑、抗氧化劑、粘合劑、pH調節劑、皮膚漂白劑和光亮劑、皮膚調理劑、防曬劑、防腐劑、抗炎劑、潤濕劑、增稠劑和維生素。對于化妝品、個人護理和/或藥物應用的某些實施方案，需要隨穩定化蛋白酶進一步包括防腐劑體系。酶已知在苛刻條件(如較高溫度和存在不相容性的化學品如強力乳化劑)下變性。與穩定化蛋白質一起使用并且特別適用于穩定化木瓜蛋白酶的兩個示例性防腐劑體系是：(a)苯氧乙醇+苯甲酸(b)Diocide(苯氧乙醇+辛二醇+己二醇的摻合物)具體地，本發明涉及以下實施方案1.一種穩定化蛋白酶產物，包含與卡波姆交聯的蛋白酶，其中所述蛋白酶的伯胺與卡波姆的羧基交聯并且其中所述蛋白酶的胺經胺反應性交聯試劑進一步交聯。2.如實施方案1所述的穩定化蛋白酶，其中所述穩定化蛋白酶還包含物理穩定劑。3.如實施方案2所述的穩定化蛋白酶，其中所述物理穩定劑是糖或糖聚合物。4.如實施方案3所述的穩定化蛋白酶，其中所述穩定化蛋白酶包含0.1％和5％之間的物理穩定劑。5.如實施方案3所述的穩定化蛋白酶，其中所述糖或糖聚合物選自藻酸鈉、海藻糖、甘露醇、甘油、黃原膠、蔗糖和山梨醇。6.如實施方案5所述的穩定化蛋白酶，其中所述物理穩定劑是藻酸鈉。7.如實施方案1所述的穩定化蛋白酶，其中所述蛋白酶選自木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶和獼猴桃蛋白酶。8.如實施方案7所述的穩定化蛋白酶，其中所述蛋白酶是木瓜蛋白酶。9.如實施方案7所述的穩定化蛋白酶，其包含0.1％和5％之間的所述蛋白酶。10.如實施方案1所述的穩定化蛋白酶，其中所述胺反應性交聯試劑選自己二亞氨酸二甲酯(DMA)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯(BS3)、辛二亞氨酸二甲酯(DMS)、庚二亞氨酸二甲酯(DMP)和辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)。11.如實施方案1所述的穩定化蛋白酶，其中所述蛋白酶是木瓜蛋白酶并且所述胺反應性交聯試劑是DMA。12.如實施方案1所述的穩定化蛋白酶產物，還包含防腐劑體系。13.如實施方案12所述的穩定化蛋白酶產物，其中所述防腐劑體系包含苯氧乙醇和苯甲酸。14.如實施方案12所述的穩定化蛋白酶產物，其中所述防腐劑體系包含diocide。15.一種形成穩定化蛋白酶的方法，包括：進行初級交聯反應以將與所述蛋白酶的伯胺與卡波姆的羧基交聯；并且借助胺反應性交聯試劑在所述蛋白酶上進行二級交聯反應。16.如實施方案15所述的方法，其中所述初級交聯反應使用交聯試劑碳二亞胺1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基磺基琥珀酰亞胺實施。17.如實施方案15所述的方法，其中用于進行二級交聯反應的交聯試劑是一種選自己二亞氨酸二甲酯(DMA)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯(BS3)、辛二亞氨酸二甲酯(DMS)、庚二亞氨酸二甲酯(DMP)和辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)的交聯試劑。18.如實施方案17所述的方法，其中所述用于進行二級交聯反應的交聯試劑是DMA。19.如實施方案15所述的方法，其中所述二級交聯反應借助按重量計1％至5％的胺反應性交聯試劑進行。20.如實施方案15所述的方法，還包括在進行所述二級交聯反應后添加物理穩定劑。21.如實施方案20所述的方法，其中所述物理穩定劑是藻酸鈉。22.一種治療干燥、老化或受損皮膚的方法，包括施加包含一種或多種如實施方案1所述的穩定化蛋白酶的化妝品組合物至所述皮膚。23.一種傷口或燒傷清創的方法，包括局部施加包含一種或多種如實施方案1所述的穩定化蛋白酶的組合物。實施例本發明在以下實施例中進一步描述，這些實施例不限制在權利要求書中描述的本發明范圍。實施例1通過進行初級交聯反應產生了保留其蛋白酶活性并且比含有游離木瓜蛋白酶更安全的穩定的木瓜蛋白酶產物，在所述初級交聯反應中，使用碳二亞胺1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)連同N-羥基磺基琥珀酰亞胺(NHS)一起，使1％木瓜蛋白酶與卡波姆交聯。接下來，隨后進行二級交聯反應，在所述二級交聯反應中，固定化木瓜蛋白酶與己二亞氨酸二甲酯(DMA)反應以進一步交聯了交聯的木瓜蛋白酶，從而形成穩定的交聯木瓜蛋白酶產物。按重量計，DMA以1％濃度提供并且木瓜蛋白酶以1％濃度提供。產生三個(3)實驗性實驗批次的以上穩定化木瓜蛋白酶產物以確定1％DMA在經過12周的貯存期后對初級交聯木瓜蛋白酶的酶活性/穩定性的影響。表1中描述了用于開展這些實驗的反應條件。表1下文在表2(a)-5(b)中描述三個獨立實驗室批次的結果，所述的實驗室批次用于確定在多個溫度下在12周時間內具有1％DMA和沒有DMA的固定化木瓜蛋白酶的保留活性。表2(a)描述了連接的固定化木瓜蛋白酶在還含有1％DMA的實驗樣品中的保留活性的百分比。表2(b)描述了固定化木瓜蛋白酶在不包括DMA的對照樣品中的保留活性的百分比。實驗樣品和對照樣品是基本上相同的，除了對照樣品不含任何DMA之外。表2(a)-以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶時間4C25C40C50C1001001001002周103.927106.80692.67075.6544周101.83298.16869.37226.706周97.90695.81255.23613.0890周96.07392.67036.9112.35612周95.81284.29612.9232.068表2(b)-固定化木瓜蛋白酶(無DMA)-對照時間4C25C40C50C0周1001001001002周96.41968.28653.70825.0644周91.04957.54547.8268.4406周90.53745.01326.0872.5588周85.16627.87712.7880.25612周78.77221.0436.1150.305表3(a)-以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶時間4C25C40C50C0周1001001001002周107.320110.00087.53065.4304周95.62092.65065.43029.766周91.42087.21056.54010.4308周87.24084.23030.1201.34012周85.35080.46010.8701.000表3(b)-固定化木瓜蛋白酶(無DMA)-對照時間4C25C40C50C0周1001001001002周92.34063.45062.87020.8704周88.01053.45044.6205.6706周84.32044.67028.9801.6508周81.76022.97010.9600.43012周72.35017.6504.3000.010表4(a)-以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶表4(b)-固定化木瓜蛋白酶(無DMA)-對照時間4C25C40C50C0周1001001001002周98.87071.82050.98027.8704周86.34052.34041.6205.7506周80.73040.21022.3201.2308周81.53020.41011.8760.91012周75.61015.6203.1100.030表5(a)-批次1(表3)、批次2(表4)和批次3(表5)的以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶的保留活性％的平均值時間4C25C40C50C0周1001001001002周103.4105.691.069.94周98.495.765.826.26周95.291.854.911.48周91.386.432.72.012周89.781.611.51.3表5(b)-批次1(表3)、批次2(表4)和批次3(表5)的(無DMA)固定化木瓜蛋白酶的保留活性％的平均值時間4C25C40C50C0周1001001001002周95.8867.8555.8555.854周88.4754.4444.6944.696周85.2043.3025.8025.808周82.8223.7511.8711.8712周75.5818.104.514.51從表2(a)-5(b)的結果可見，在實驗樣品中以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶的活性在多個溫度下顯著地大于對照樣品中未與DMA反應的固定化木瓜蛋白酶的活性。因此，已經歷過初級交聯反應以使木瓜蛋白酶與卡波姆交聯并且隨后經歷與1％DMA二級交聯反應的木瓜蛋白酶明顯比已經歷過初級交聯反應但未經歷與DMA二級交聯反應的木瓜蛋白酶對照樣品更穩定。另外，圖3和圖4說明了表2(a)-5(b)的結果，即，已經以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶的活性在多個溫度下顯著地大于對照樣品中未與DMA反應的固定化木瓜蛋白酶的活性。如下文在表6和表7中描述，基于每單位固定化木瓜蛋白酶樣品的熒光變化確定實驗樣品和對照樣品中的木瓜蛋白酶活性。形成如圖5中所顯示的Sigma木瓜蛋白酶活性標準曲線以輔助定量根據本實施例以1％DMA交聯的固定化木瓜蛋白酶的活性。如上文指出，使用蛋白酶分析試劑盒(E-6639)來獲得這條標準曲線和每單位本發明實驗樣品的熒光變化。表6-具有1％DMA和沒有DMA(對照)的固定化木瓜蛋白酶的熒光值表7-以單位/ml測量的具有1％DMA的1％固定化木瓜蛋白酶和無DMA的固定化木瓜蛋白酶(對照)的活性在其他實驗中，在4℃、25℃和45℃的溫度下在12周內將交聯的1％木瓜蛋白酶隨1％DMA一起貯存并且交聯的1％木瓜蛋白酶不與DMA一起貯存，以確定這些木瓜蛋白酶樣品在這些溫度下的穩定性。使用Invitrogen分析試劑盒，N＝3，通過木瓜蛋白酶活性測定法獲得這個實驗的結果。如圖6(a)-圖6(b)中所示，用DMA交聯固定化木瓜蛋白酶顯著改進產物在25℃和45℃的穩定性，與其中連接的木瓜蛋白酶不與DMA一起貯存的對照樣品相比。圖6(a)說明在貯存含有由DMA交聯的連接的木瓜蛋白酶的樣品多達12周后所保留的活性的百分比。圖6(b)說明貯存多達12周的對照樣品，所述對照樣品含有不含DMA的連接的木瓜蛋白酶。進一步指出，如6(a)圖中所示，確定了由DMA交聯的連接的木瓜蛋白酶在4℃和25℃下持續12周時保留超過約80％的活性并且在45℃保留約50％的活性。在其他實驗中，如圖7中所顯示，實施了穩定化木瓜蛋白酶中游離的活性木瓜蛋白酶的測定。該實驗的結果是，確定在已經根據本發明的示例性實施方案的在初級交聯反應中通過EDC/NHS交聯并且隨后在二級交聯反應中通過1％DMA進一步交聯的木瓜蛋白酶中不存在游離的活性木瓜蛋白酶。另一方面，在未交聯的對照樣品的木瓜蛋白酶中存在顯著的游離木瓜蛋白酶活性。實施例2在實施例2中，作為用作二級交聯劑的DMA的替代，使用0.2％的交聯劑BS3在二級交聯反應中交聯固定化木瓜蛋白酶產物。在表8-10中說明并且在下文討論用于確定隨0.2％BS3一起貯存的固定化木瓜蛋白酶實驗樣品和不隨BS3一起貯存的固定化木瓜蛋白酶對照樣品的活性百分比的操作方案、反應物、反應條件和結果。表8表9表10在1周后保留的活性-4C活性％無BS30.2％BS34C99.95799.91225C52.389111.64340C18.847122.47950C5.05293.851從表10和圖8的結果可見，已經用0.2％BS3進一步交聯的固定化1％木瓜蛋白酶的活性在多個溫度下顯著地大于對照樣品中未與BS3反應的固定化木瓜蛋白酶的活性。實施例3在這個實施例中，1％穩定化木瓜蛋白酶和0.1％藻酸鈉組合。下文討論用于確定隨0.1％藻酸鈉一起貯存的穩定化木瓜蛋白酶的實驗樣品和不隨藻酸鈉一起貯存的穩定化木瓜蛋白酶產物的對照樣品的活性百分比的操作方案、反應物、反應條件和結果。表11表12表13測試的樣品(4周連接的木瓜蛋白酶樣品-在101607木瓜蛋白酶濃度1％上制備)第1周第2周第3周第4周從表13的結果可見，已經隨0.1％藻酸鈉一起貯存的穩定化木瓜蛋白酶的活性在多個溫度下在4周內顯著地大于對照樣品中未隨藻酸鈉一起貯存的穩定化木瓜蛋白酶的活性。因此，與0.1％藻酸鈉反應的連接的木瓜蛋白酶比上文提到的不包括藻酸鈉的木瓜蛋白酶對照樣品顯著更穩定。另外，圖9說明表13的結果：具有藻酸鈉的穩定化木瓜蛋白酶的活性在多個溫度下在4周內顯著地大于對照樣品中不包括藻酸鈉的交聯木瓜蛋白酶的活性。另外，如圖10中所示，使用吸光度和單位/ml形成Sigma木瓜蛋白酶活性標準曲線以輔助定量與0.1％藻酸鈉在一起的連接的1％木瓜蛋白酶的活性。在其他實驗中，如圖11中所示，實施糖或糖聚合物在25℃和40℃下數天后對游離木瓜蛋白酶的穩定性的影響。所包含的糖或糖聚合物是0.1％藻酸鈉、5％海藻糖、5％甘露醇、5％甘油、0.1黃原膠、0.1％HA、5％蔗糖、5％山梨醇和無糖對照。從這個結果中指出，發現0.1％藻酸鈉對游離的木瓜蛋白酶具有穩定作用。還在本發明的穩定化木瓜蛋白酶上觀察到0.1％藻酸鈉的這種穩定作用。在其他實驗中，如圖12中所示，測定了用0.4％木瓜蛋白酶制成的穩定化木瓜蛋白酶在2周后保留的活性的百分比。在這些實驗的一些樣品中，連接的木瓜蛋白酶用藻酸鈉處理，在一些樣品中，連接的木瓜蛋白酶用酐處理，在一些樣品中，連接的木瓜蛋白酶用酐和藻酸鈉處理，并且在一些樣品中，連接的木瓜蛋白酶完全不用以上任何物質處理。如可以從圖12中發現，用藻酸鈉和酐同時處理的樣品在兩周的每周后具有最大的保留活性％，并且完全不做處理的樣品在兩周的每周后具有最低的保留活性％。實施例4在實施例4中，固定化木瓜蛋白酶與1％DMA反應以進行二級交聯，并且為進一步穩定性與0.1％藻酸鈉反應，并且被包括作為包含1.2％苯氧乙醇+0.2％苯甲酸的防腐劑體系的一部分。在表14中顯示并且下文討論用于確定根據本發明一個實施方案的穩定化木瓜蛋白酶實驗樣品和連接的木瓜蛋白酶產物(不含DMA或藻酸鈉)的對照樣品的活性％的操作方案、反應物、反應條件和結果。表14使用InvitrogenE6639EnzChek試劑盒時酶活性的分析方案木瓜蛋白酶標準曲線制備1單位/mL的木瓜蛋白酶儲備液10mgSigma木瓜蛋白酶25mldl1×消化緩沖液材料及緩沖液要求：0.1M碳酸氫鈉，pH8.31×消化緩沖液：PBSpH6+50μlTX-100BODIPYTRX酪蛋白的1mg/ml儲備液＝1小瓶底物并溶解于0.2ml碳酸氫鹽緩沖液中10μg/mLBODIPY酪蛋白工作溶液：在50mlfalcon中添加19.8ml消化緩沖液中的0.2mL儲備液底物測定法：20μl的STD/樣品80μl的1×消化緩沖液100μl的BODIPY酪蛋白的10μg/mL工作溶液樣品：25μl連接的木瓜蛋白酶與含有0.1％TritonX-100的50μl1×消化緩沖液混合方法：在室溫孵育平板1小時，伴以溫和攪拌。使平板避光。在熒光微量平板讀數儀中讀取熒光。使用標準熒光濾光器，激發590/25nm，發射620/40nm表15具有或沒有1％DMA的連接木瓜蛋白酶樣品(12周樣品)貯存后保留的活性％如上文指出，根據本發明示例性實施方案的實驗樣品包含1％DMA、1％木瓜蛋白酶600(ESP)、0.1％藻酸鈉、1.2苯氧乙醇+0.2％苯甲酸。對照樣品包含與實驗性制劑樣品完全相同的組分，除了對照樣品不包括DMA之外。下文描述了在12周時間內在多種溫度下DMA對連接的木瓜蛋白酶的保留活性的影響的結果。另外，在圖13(a)中顯示DMA、連接的木瓜蛋白酶和藻酸鈉的化學。從以上數據和圖13(b)、13(c)、圖14及圖15中可以發現，與不含有任何DMA的對照樣品相比，連接的木瓜蛋白酶與1％DMA的交聯顯著地改善連接的木瓜蛋白酶產物在多種溫度下在12周時間內的穩定性。另外，如上文在表15中所述，基于每單位連接的木瓜蛋白酶樣品的熒光變化確定實驗樣品和對照中的木瓜蛋白酶活性。形成如圖16中所顯示的Sigma木瓜蛋白酶標準曲線，以輔助定量根據本實施例用1％DMA進一步交聯的固定化1％木瓜蛋白酶的活性。如上文指出，使用蛋白酶分析試劑盒(E-6639)來獲得這條標準曲線和根據本發明示例性實施方案的含有DMA的固定化木瓜蛋白酶的實驗樣品和不含DMA的對照樣品的每單位樣品熒光變化。實施例5在另一個示例性實施方案中，固定化木瓜蛋白酶與5％DMA反應以便進一步交聯，并且與0.1％藻酸鈉反應，并且被包括作為包含1.2％苯氧乙醇+0.2％苯甲酸的防腐劑體系的一部分。下文描述這個實施方案的操作方案和結果。安慰劑制劑含有實驗制劑的全部組分，除DMA之外。表16第0周活性％從以上數據表和圖17-19中可以發現，與不含有任何DMA的對照樣品相比，固定化木瓜蛋白酶與5％DMA的交聯顯著地改善固定化木瓜蛋白酶產物在多種溫度下在12周時間內的穩定性。另外，如在以上數據表中所述，基于每單位固定化木瓜蛋白酶樣品的熒光變化確定實驗樣品和對照中的木瓜蛋白酶活性。形成如圖20中所顯示的在安慰劑制劑中Sigma木瓜蛋白的酶標準曲線，以輔助定量根據本實施方案用5％DMA交聯的固定化1％木瓜蛋白酶的活性。如上文指出，使用蛋白酶分析試劑盒(E-6639)來獲得這條標準曲線和根據本發明示例性實施方案的含有DMA的連接木瓜蛋白酶的實驗樣品和不含DMA的對照樣品的每單位樣品熒光變化。實施例6-8以下代表可以使用一種或多種穩定化蛋白酶制得的制劑的非限制性實施例。本領域已知多種相似的制劑，可以向其中容易地以多種濃度并入一種或多種穩定化蛋白酶。實施例6一種示例性彈性乳膏劑凝膠具有例如下表中所示的組成：在一個主要容器中，合并相A。均勻混合并且轉動混合(sweep-mix)直至粉末水合并且批料均勻。當相A均勻時，添加相B至主要容器，同時均勻混合。混合直至均一。添加相C至主要容器，同時均勻混合。混合直至均一。添加相D至主要容器，同時均勻混合。混合直至均一。加溫相E成分至150℃至40℃直至熔化。預混相E并且添加至主要容器，同時均勻混合。預混相F。混合直至全部微粒懸浮并且不存在團塊。在添加期間繼續混合。添加相F至主要容器，同時均勻混合。在添加后關閉均勻混合器并且旋轉混合直至均一。實施例7一種示例性洗劑具有例如下表中所示的組成：混合相A直至均勻，同時加熱至65-70℃。在單獨的容器中，預混相B。加熱至70-75℃或直至均勻。當相A和B均處于所需的溫度時，添加相B至相A并且均勻混合直至均一。當相AB是均勻時，開始冷卻。在35-30℃添加相C并且在合適的混合器中混合直至均一。在均質混合器下添加預混合的相D至相ABC。混合直至均一。實施例8在這個實施方案中，在O/W制劑中連接的木瓜蛋白酶在多種溫度下穩定多達12周。在0.1％TritonX-100，n＝3中懸浮制劑后，使用InvitrogenEnzChek分析試劑盒，通過木瓜蛋白酶活性測定法獲得結果。如21圖中所示，連接的木瓜蛋白酶產物由水包油制劑進一步穩定。在45C下12周后，約75％活性保留。發現制劑在測試的全部溫度下是穩定的。這些結果表明，當交聯的木瓜蛋白酶產物包含于油和水制劑中時，這種產物甚至進一步穩定。已經描述本發明的示例性實施方案的情況下，應當進一步指出，對于本領域技術人員輕易顯而易見的是，可以產生多種修改而不脫離由所附權利要求書的界限和范圍限定的本發明的精神和范圍。當前第1頁1 2 3