本發明屬于生物防治領域，具體涉及一種用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿菌；還涉及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治番茄灰霉病上的用途。
背景技術：
：番茄灰霉病是由半知菌亞門的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一種重要病害。該病害主要危害果實，造成果實腐爛，也可危害葉、莖和花，造成的產量損失高達20％～50％；嚴重威脅保護地番茄生產。防治番茄灰霉病的方法主要有：(1)培育抗病品種：這是最為經濟有效的方法，但是由于抗源材料有限，以及由于生物的共同進化，不斷出現新的病原菌的生理小種，因此培育抗病品種途徑效果有限；(2)化學防治：這是防治番茄灰霉病的主要手段，但是使用化學藥劑防治存在抗藥性喪失和環境污染的問題，嚴重危害人畜的健康；(3)生物防治：由于具有專化性強、不易產生抗藥性、藥效持久等優點，日益受到人們的青睞。芽孢桿菌(Bacilliussp)具有分布廣、易分離培養、能產生抗逆性較強的芽胞、貯藏期長和使用方便等優點，成為一種理想的生防微生物。目前用于防治番茄灰霉病的芽孢桿菌主要有：地衣芽孢桿菌(CN104232499A)、短小芽孢桿菌(CN101928681A)、解淀粉芽孢桿菌(CN103173397A、CN104531559A、CN105176894A、CN104762223A、CN102604864A、CN105199996A、CN104498386A)、環狀芽孢桿菌(CN103952352A)、枯草芽孢桿菌(CN1934241A、CN103074271A、CN101993836A、CN101148650A)、側孢短芽孢桿菌(CN104480046A)和深褐芽孢桿菌(CN104946567A)等。從以上可以看出，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。技術實現要素：本發明目的在于提供一種用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、殺菌譜廣等優點。本發明另一目的在于提供一種微生物菌劑。本發明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在防治番茄灰霉病上的用途。本發明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治番茄灰霉病上的用途。本發明通過以下技術方案實現：本發明提供了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27636，己于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.13038。利用上述解淀粉芽孢桿菌HMB27636生產的微生物菌劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌HMB27636菌體。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：將低溫保存的HMB27636菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上，在25～35℃培養10～16小時，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無菌的接種環刮取一接種環步驟(1)活化的菌株并接種到100mLLB液體培養基中，在25～35℃、搖床轉速為150～220rpm條件下培養10～16小時，得種子液；(3)發酵培養：按照體積比為1～3％的比例將步驟(2)的種子液接種到玉米粉黃豆粉培養基(pH值為7.2)中，在25～35℃、搖床轉速為150～220rpm的條件下發酵培養40～50h，得發酵液；(4)檢測發酵液中菌體和芽胞數量，待發酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數的90％時停止發酵培養，所得即為HMB27636菌株的液體制劑。上述制備方法中所述的LB平板培養基、LB斜面培養基或LB液體培養基均按照常規方法制備。上述制備方法步驟(1)中所述LB平板培養基或LB斜面培養基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，瓊脂粉12～18g，水1000mL。上述制備方法步驟(2)中所述LB液體培養基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，水1000mL。上述制備方法步驟(3)中所述的玉米粉黃豆粉培養基，其組成成分及其重量百分比為：玉米粉1.0～3.0％，黃豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余為水。所述的玉米粉黃豆粉培養基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，調節pH攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其解淀粉芽孢桿菌HMB27636的活菌數大于21.0×108cfu/mL。上述解淀粉芽孢桿菌HMB27636在防治番茄灰霉病上的應用。上述微生物菌劑在防治番茄灰霉病上的應用。上述微生物菌劑的使用方法：用水將上述所得微生物菌劑稀釋至活菌體數為107cfu/mL，于番茄灰霉病發病前進行葉面噴霧即可。本發明HMB27636菌株的篩選分離過程：2013年4月河北省農林科學院植物保護研究所從湖北省荊州市棉田中五點采集土樣，混勻后稱取1g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入100mL無菌水，放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液10mL加入50mL滅菌離心管中，在80℃恒溫水浴30分鐘，然后取1mL加無菌水9mL，即成10mL10-3倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10-4、10-5、10-6倍稀釋液；取各濃度微生物懸液200μL涂于LB培養基平板上，每個濃度重復3次，在30℃恒溫培養1d～3d，進行細菌的分離和純化。并以番茄灰霉病為靶標，通過平板對峙法、離體葉片法、盆栽試驗法進行生防菌的篩選。結果從中篩選出一個對番茄灰霉病具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB27636。HMB27636菌株的分類鑒定：(1)形態特征鑒定在LB培養基上培養菌體為桿狀，培養10h后產生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中靜止培養，表面形成白色菌膜。這些形態特征與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特征基本一致，初步判斷菌株HMB27636屬于芽孢桿菌。(2)利用16SrDNA序列鑒定分類以HMB27636的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16SrDNA進行PCR擴增，所述的引物序列為：F27：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQIDNo:1)；R1492：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNo:2)。PCR的反應體系為50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB27636的基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30個循環；72℃10min。將所得PCR擴增產物進行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測序，得到HMB27636的16SrDNA序列(見SEQIDNo:3)。將所得HMB27636的16SrDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株HMB27636與芽孢桿菌屬的16SrDNA同源性達到99％；構建系統發育樹(見圖1)，HMB27636與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明HMB27636屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以HMB27636基因組DNA為模板，以芽孢桿菌gyrB基因簡并引物gyrB-F和gyrB-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為：gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQIDNo:4)；gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQIDNo:5)。gyrB的PCR的反應體系為50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB27636基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30個循環；72℃10min。將擴增產物送交上海生工生物工程有限公司測序，得HMB27636菌株的gyrB基因序列(見SEQIDNo:6)。將HMB27636菌株的gyrB基因序列在Genbank中進行同源性比較，結果發現HMB27636與解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達到98.25％；同時利用MEGA軟件構建系統發育樹(見圖2)，HMB27636菌株與解淀粉芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB27636為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一個新菌株。綜合以上形態特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性對比分析的結果，可知HMB27636屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和現有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的解淀粉芽孢桿菌菌株。本發明具有的優點和有益效果：(1)本發明為防治番茄灰霉病提供了一個高效的微生物，開辟了一個有效防治途徑；(2)本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病的防治效果好，平均防效在80.0％以上；(3)本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境污染；(4)利用本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636防治番茄灰霉病專化性強，不易產生抗藥性；(5)本發明微生物菌劑制備方法簡單、成本低、使用簡單。附圖說明圖1.為根據16SrDNA序列獲得的HMB27636菌株系統發育樹圖。圖2.為根據gyrB基因序列獲得的HMB27636菌株系統發育樹圖。具體實施方式下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發明，但是不以任何方式構成對本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法；下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量百分含量。實施例1HMB27636微生物菌劑的制備按照如下步驟進行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27636(己于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13038)在LB平板培養基((其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL))上進行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養基((其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL))上在30℃下培養12小時，得活化的菌株；(2)種子液的制備：在250mL三角瓶中裝入LB液體培養基((其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000mL))100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環步驟(1)中活化好的菌株，在30℃、搖床轉速190rpm的條件下進行振蕩培養12小時，得種子液；(3)玉米粉黃豆粉培養基的制備：按照重量百分比將玉米粉1.5％，黃豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃對玉米粉黃豆粉培養基進行滅菌30分鐘，再降溫到30℃備用；(4)發酵培養：向步驟(3)所得每瓶玉米粉黃豆粉培養基200mL中接種步驟(2)所得的種子液2mL；在30℃、搖床轉速180rpm條件下進行發酵培養36小時，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽胞和總菌體數進行計數，并計算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞數/(成熟芽胞數+菌體數)×100)；芽胞率達到90％時停止發酵培養；共發酵培養48小時，得解淀粉芽孢桿菌HMB27636的液體制劑。實施例2解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉菌的拮抗作用試驗(一)供試番茄灰霉病菌來源：番茄灰霉病菌BC-1菌株采自河北省保定市容城縣東牛東莊村番茄病果，經河北省農林科學院植物保護研究所分離純化，河北農業大學鑒定為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，致病力測定表現為強致病力。(二)試驗方法：本試驗于2014年4月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。首先將番茄灰霉病菌BC-1在PDA平板上活化培養4天，然后用打孔器在菌落邊緣區域打孔制成菌片，接著將番茄灰霉病菌BC-1菌片轉接在另一個PDA平板中央，再將實施例1步驟(1)活化后的解淀粉芽孢桿菌HMB27636點接在距指示菌菌片2.0厘米處，設空白對照(不點接HMB27636菌株)。在25℃恒溫培養，待空白對照即將長滿整個培養皿時，測量番茄灰霉菌的對照生長量(菌落半徑)和處理生長量(接種HMB27636后的抑制生長半徑)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率的計算公式為：抑菌率(％)＝(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100)。結果(見表1)本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉菌的抑制率達68.2％；透明的抑菌帶寬2.0毫米，細菌生長達11毫米，空間競爭和營養競爭作用很強；說明解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉菌具有明顯的抑制作用，具有防治番茄灰霉病的生防潛力。表1HMB27636菌株對番茄灰霉病菌的拮抗作用試驗結果實施例3解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效對比試驗(一)試驗處理：(1)微生物菌劑：實施例1制備的HMB27636液體制劑，用水稀釋50倍。(2)化學藥劑：嘧菌酯懸浮劑(250克/升)(英國先正達有限公司)，用水稀釋500倍。(3)空白對照：清水(二)試驗方法：本試驗在河北省農林科學院植物保護研究所植病生防實驗室內進行。在50孔育苗盤中培育奧塞特(968)(購自北京碩源種子公司)的番茄苗，長出2片復葉時移栽到直徑20厘米的花盆中，每盆1棵苗。植株生長至7-8片復葉時，選用葉齡一致，大小一致的葉片，先用無菌水沖洗葉表，然后用無菌濾紙吸干水分，再在實施例1制備的解淀粉芽孢桿菌HMB27636菌劑水稀釋液(含菌體107cfu/mL)中蘸一下，使葉子表面充分著藥，然后放于鋪有雙層滅菌濾紙的培養皿中，同時接入番茄灰霉病菌BC-1菌盤(直徑6mm)，保濕培養。以未用HMB27636菌劑處理的葉片為空白對照。待空白對照充分發病后調查病斑直徑，計算防治效果。結果(見表2)在離體葉片生測試驗中，解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病具的防效達72.77％，與化學對照藥劑的防效(80.38％)差異不顯著。說明解淀粉芽孢桿菌HMB27636及其微生物菌劑對番茄灰霉病具有很好的防治效果。表2解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效對比試驗結果處理病斑直徑(mm)防效(％)HMB27636液體制劑7.2b72.77化學藥劑5.2b80.38空白對照26.5a--實施例4解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效對比試驗(一)試驗處理：(1)微生物菌劑：實施例1制備的HMB27636液體制劑；用水稀釋50倍。(2)化學藥劑：嘧菌酯懸浮劑(250克/升)(英國先正達有限公司)；用水稀釋500倍。(3)空白對照：清水(二)試驗方法：2013年12月在河北省農林科學院植物保護研究所人工氣候室內進行。在日光溫室培育奧塞特(968)(購自北京碩源種子公司)的番茄苗，待番茄生長出8片復葉，移至控溫控濕培養室，選取大小一致的番茄苗，將實施例1制備的HMB27636液體制劑50倍水稀釋液均勻噴灑在番茄苗上，在25℃培養24小時，然后在每片小葉上接入番茄灰霉病菌BC-1菌盤(PDA平板上25℃下培養3-5d，直徑6mm)，保濕培養3d。設清水空白對照和化學藥劑處理。調查發病結果，采用十字測量法測量每個病斑直徑(A,B)，計算病斑面積和防治效果。病斑面積(mm2)＝π×A×B/4；防治效果(％)＝(對照病斑面積-處理病斑面積)/對照病斑面積×100。表3解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效的對比試驗結果處理病斑面積(mm2)防效(％)HMB27636液體制劑18.96c83.19化學藥劑30.42b73.02空白對照112.76a--結果(見表3)在活體生測試驗中，本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636處理的病斑面積顯著小于化學藥劑處理和空白對照的病斑面積，對番茄灰霉菌在番茄葉片上的擴展的抑制作用顯著；本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636菌劑對番茄灰霉病的防效為83.19％，也明顯高于化學藥劑73.02％的防效。說明解淀粉芽孢桿菌HMB27636及其微生物菌劑對番茄灰霉病防治效果好。實施例5解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效的田間對比試驗(一)試驗處理：(1)微生物菌劑：實施例1制備的HMB27636液體制劑，用水稀釋50倍。(2)化學藥劑：嘧菌酯懸浮劑(250克/升)(英國先正達有限公司)；用水稀釋500倍。(3)空白對照：清水(二)試驗方法：2014年2月至6月在河北省保定市滿城縣大賽村孫茂龍番茄大棚進行。開始試驗時整個棚內番茄葉部灰霉病中度發生，施藥前摘除病葉。每小區3行，4次重復，隨機區組排列。采用背負式電動噴霧器接種實施例1制備的解淀粉芽孢桿菌HMB27636液體制劑的50倍水稀釋液(含菌體107cfu/mL)；另設化學藥劑處理和空白對照。首次施藥7天后再噴施1次，第二次施藥后的第七天調查各個處理小區的單株病葉數，并計算防效。結果(見表4)本發明解淀粉芽孢桿菌HMB27636的菌劑處理后番茄灰霉病的單株病葉數顯著低于空白對照和化學藥劑處理，其防效達到78.72％，高于化學藥劑的防效，說明本發明解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27636及其菌劑對番茄灰霉病的防治效果好。表4解淀粉芽孢桿菌HMB27636對番茄灰霉病防效對比試驗結果處理單株病葉數(片)防效(％)HMB27636液體制劑1.0c78.72化學藥劑1.33b71.52空白對照4.67a--當前第1頁1 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