本發明屬于農業微生物領域，具體涉及一種具有降解無機磷和抑菌雙重功能的解淀粉芽孢桿菌，以及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還涉及它們在促進作物生長和防病方面的用途。
背景技術：
：磷是植物生長過程中必需的營養元素之一。我國土壤中總磷含量相當可觀，但95％以上是以穩定的鋁硅酸鹽和磷灰石等無效磷形式存在，植物很難直接吸收利用。因此絕大多數農作物都要追施磷肥。目前主要施用的速效磷肥生產成本高、能耗大，施入的磷肥當年利用率僅為10％-25％，其中一部分磷肥隨雨水流入江河湖泊，造成水體的富營養化，引起水質污染；另一部分磷與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等結合，形成難溶性磷酸鹽，植物無法吸收利用，并帶來一系列如土壤板結，污染環境，生物多樣性遭到破壞等嚴峻的問題。因此，提高有效磷在土壤中的含量，促進作物吸收磷元素，從而增加作物產量是農業生產上亟待解決的問題。影響土壤中有效磷含量的因素很多，其中微生物對土壤磷的利用率、土壤磷的轉化和有效性影響很大，并且微生物本身具有無毒無害、不污染環境、成本低、節約能源等優點。近年來國內外研究者提出了應用微生物改變磷的固定方式并開展了解磷細菌的研究，該類細菌不僅可以降解難溶性磷，而且具有防治作物病害的功能，大部分以芽孢桿菌為主。為進一步提高磷肥的當季利用率，減少土壤對磷酸鹽的吸附固定，充分發揮難溶性磷酸鹽的潛力，使其能為作物吸收利用，應篩選并研制具有肥效功能和防病功能的微生物及其微生物菌劑，技術實現要素：本發明目的在于提供一種具有降解無機磷和抑菌雙重作用的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株降解無機磷能力強，并且具有高效抑菌和抑菌譜廣等優點。本發明另一目的在于提供一種微生物菌劑。本發明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在降解無機磷上的用途。本發明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌促進作物生長的用途。本發明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌防治棉花病害的用途。本發明第六目的在于提供上述微生物菌劑在降解無機磷上的用途。本發明第七目的在于提供上述微生物菌劑在促進作物生長上的用途。本發明第八目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉花病害上的用途。本發明通過以下技術方案實現：本發明提供了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株PHODG36，己于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.13041。本發明還提供了利用上述解淀粉芽孢桿菌PHODG36生產的微生物菌劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌PHODG36菌體。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：將低溫保存的PHODB36菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上，在25～35℃培養10～16小時，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無菌的接種環刮取一環步驟(1)活化的菌株接種到100mLLB液體培養基中，在25～35℃、搖床轉速為150～220rpm的條件下培養10～16小時，得種子液；(3)發酵培養：按照體積比為1～3％的比例將步驟(2)的種子液接入到玉米粉黃豆粉培養基(pH值為7.2)中，在溫度為25～35℃、搖床轉速為150～220rpm的條件下發酵培養30～40h，得發酵液；(4)檢測發酵液中菌體和芽胞數量，待發酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數的90％時停止發酵培養；所得即為PHODB36菌株的液體制劑。所述的LB平板培養基、LB斜面培養基和LB液體培養基均按照常規方法制備。上述制備方法步驟(1)中所述的LB平板培養基或LB斜面培養基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，瓊脂粉12～18g，水1000mL。上述制備方法步驟(1)中所述的LB液體培養基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，水1000mL。上述制備方法步驟(3)中所述的玉米粉黃豆粉培養基，其組成成分及其重量百分比為：玉米粉1.0～3.0％，黃豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余為水。所述的玉米粉黃豆粉培養基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，調節pH攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，所述的解淀粉芽孢桿菌PHODG36的活菌數大于1.8×108cfu/mL。上述解淀粉芽孢桿菌PHODG36在降解無機磷上的應用。上述解淀粉芽孢桿菌PHODG36在促進作物生長上的應用。上述解淀粉芽孢桿菌PHODG36在防治棉花病害上的應用。上述應用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑在降解無機磷上的應用。上述微生物菌劑在促進作物生長上的應用。上述微生物菌劑在防治棉花病害上的應用。上述應用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑的使用方法：用水將上述所得微生物菌劑稀釋至活菌體數為107CFU/mL，于番茄移栽定植后進行灌根即可。PHODG36菌株的篩選分離過程2012年8月河北省農林科學院植物保護研究所從河北省保定市定興縣東引村玉米田中五點采集土樣，稱取1.0g風干土樣加入帶滅菌玻璃珠的三角瓶中，再加入100mL無菌水，靜置20min，在搖床上30℃、180r/min充分振蕩30min，然后按10倍稀釋法進行梯度稀釋，分別取10-3，10-4，10-5的稀釋液100μL，涂布于解無機磷培養基上，每個濃度3個重復。涂好后在潔凈臺中靜置5-10min，待菌液吸附進培養基內，于35℃恒溫培養5-7d，進行細菌的分離和純化。并以透明圈法、鉬銻抗比色法、平板對峙法、盆栽試驗法進行篩選具有解磷功能和抑菌功能的菌株，定名為PHODG36。PHODG36菌株的分類鑒定：(1)形態特征鑒定在LB培養基上培養菌體為桿狀，培養10h后產生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中靜止培養，表面形成白色菌膜。這些形態特征與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特征基本一致，初步判斷菌株PHODG36屬于芽孢桿菌。(2)利用16SrDNA序列鑒定分類以PHODG36的基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物對16SrDNA進行PCR擴增，得PCR擴增產物；所述的引物序列為：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；(SEQIDNo:1)1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；(SEQIDNo:2)16SrDNA的PCR反應體系為50μL：10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL；PHODG36的基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1.5min，35個循環；72℃10min。將PCR擴增產物進行凝膠電泳，送往上海生工生物工程有限公司測序，得PHODG36的16SrDNA序列(見SEQIDNo:3)。將PHODG36的16SrDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株PHODG36與芽孢桿菌屬的16SrDNA同源性達到100％；同時利用MEGA軟件(分子進化遺傳分析軟件)構建系統發育樹(見圖1)，PHODG36與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明PHODG36屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以PHODG36基因組DNA為模板，以芽孢桿菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為：gyrB-F：5'-GAAGCACGGACAATCACC-3'(SEQIDNo:4)；gyrB-R：5'-TCCAAAGCACTCTTACGG-3'(SEQIDNo:5)。gyrB的PCR反應體系為50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)2μL，gyrB-R(10μmol/L)2μL；PHODG36基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35個循環；72℃10min。將PCR擴增產物送交上海生工生物工程有限公司測序，得PHODG36菌株的gyrB基因序列(見SEQIDNo:6)。將PHODG36菌株的gyrB基因序列在Genbank中進行同源性比較，結果發現PHODG36與解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達到99.0％；同時利用MEGA軟件(分子進化遺傳分析軟件)構建系統發育樹(見圖2)，結果PHODG36菌株與解淀粉芽孢桿菌聚合到一起，說明PHODG36為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一個新菌株。綜合以上形態特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性對比分析的結果，可知PHODG36屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和現有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的解淀粉芽孢桿菌菌株。本發明具有的優點和有益效果：(1)本發明PHODG36菌株降解無機磷效果好，為促進作物生長提供了一個高效的微生物；(2)本發明PHODG36菌株抑菌效果好、抑菌譜廣，對棉花黃萎病、枯萎病和立枯病的三種病原菌均有很好的抑制作用；(3)本發明解淀粉芽孢桿菌PHODG36肥效高，經過菌株PHODG36處理番茄株高、地上鮮重、地下鮮重、基質和植株磷含量分別比對照增加了64.27％、26.74％、42.36％、126.42％、27.41％；(4)本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境污染問題；(5)本發明制備方法簡單、成本低、使用簡單。附圖說明圖1為根據16SrDNA序列獲得的PHODG36菌株系統發育樹。圖2為根據gyrB基因序列獲得的PHODG36菌株系統發育樹。具體實施方式下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發明，但是不以任何方式構成對本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1解淀粉芽孢桿菌PHODG36微生物菌劑的制備按照如下步驟進行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的解淀粉芽孢桿菌菌株PHODG36(該菌株己于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13041)在LB平板培養基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上進行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培養12小時，得活化的菌株；(2)種子液的制備：按常規方法制作LB液體培養基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中裝入LB液體培養基100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環步驟(1)中活化好的菌株，在30℃、搖床轉速190rpm條件下進行振蕩培養12小時，得種子液；(3)玉米粉黃豆粉培養基的制備：按照重量百分比將玉米粉1.5％，黃豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃對玉米粉黃豆粉培養基進行滅菌30分鐘，再降溫到30℃備用；(4)發酵培養：向步驟(3)所得每瓶玉米粉黃豆粉培養基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL；在30℃、搖床轉速180rpm條件下進行發酵培養24小時，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽胞和總菌體數進行計數，并計算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞數/(成熟芽胞數+菌體數)×100)；芽胞率達到90％時停止發酵培養；共發酵培養36小時，得解淀粉芽孢桿菌PHODG36的液體制劑。實施例2解淀粉芽孢桿菌PHODG36降解無機磷定性測定試驗按照如下方法進行：用滅菌牙簽將實施例1步驟(1)中活化好的菌株PHODG36點接接種在解無機磷平板培養基(其組成成分及其重量比為：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.2g，Ca3(PO4)25.0g，KCl0.2g，MnSO40.03g，FeSO40.003g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH：7.0-8.0)上，置于30℃恒溫培養箱培養5天，測量透明圈直徑及菌落的直徑。結果解淀粉芽孢桿菌PHODG36在含有Ca3(PO4)2的無機磷平板培養基上產生直徑12.0毫米的透明圈，說明解淀粉芽孢桿菌PHODG36能夠很好降解無機磷Ca3(PO4)2，具有降解土壤中無機磷的潛力。實施例3解淀粉芽孢桿菌PHODG36降解無機磷能力定量測定試驗本試驗于2015年8月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。按照如下方法進行：(1)發酵培養基制備：按照比例將葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.2g，Ca3(PO4)25.0g，KCl0.2g，MnSO40.03g，FeSO40.003g加入到蒸餾水1000mL中，混合均勻，即得發酵培養基(pH：7.0-8.0)。將發酵培養基50mL裝入300mL錐形瓶中，高溫高壓滅菌。(2)發酵液制備：將實施例1步驟(2)所得的PHODG36菌株種子液和空白對照培養液(不接種PHODG36菌株的LB液體培養基)分別按照重量百分比為4％的比例接種到步驟(1)制備的發酵培養基中，每組3個重復，在30℃、180r/min培養6d，得發酵液。(3)發酵液處理：將步驟(2)中培養好的發酵液轉移至無菌的離心杯中，采用KQ5200DE型數控超生波清洗器進行超聲波細胞破碎，破碎條件：200-240V，2A，50/60Hz，時間20min。使之釋放出細胞內的有效磷。以8000r/min的轉速離心10min后取2.5mL上清液于50mL比色管中，加2滴2，4-二硝基苯酚作指示劑，用10％NaOH和5％稀硫酸溶液調節pH值至溶液剛呈微黃色，加鉬銻抗顯色劑5mL，定容，反應30min后。用T6新世紀紫外可見分光光度計測定上清液在720nm處的OD值。根據標準曲線得出上清液中的有效磷含量。結果計算：由樣品溶液比色所得吸收值在工作曲線上算出相應的比色溶液的含磷量(mg/L)，再按下式計算發酵液中有效磷含量：有效磷(mg/L)＝比色液的磷(mg/L)×稀釋倍數。結果(見表1)接種解淀粉芽孢桿菌PHODG36的發酵培養液中可溶性磷含量與空白對照相比增加到79.69mg/L，表明解淀粉芽孢桿菌PHODG36菌株具有降解無機磷磷酸三鈣的能力。表1解淀粉芽孢桿菌PHODG36降解無機磷能力定量測定試驗結果菌株編號OD720(nm)可溶性磷含量(mg/L)PHODG361.57379.69實施例4解淀粉芽孢桿菌PHODG36促進番茄植株的生長對比試驗(一)試驗處理：(1)處理1：磷酸三鈣+PHODG36發酵液+缺磷營養液；(2)處理2：磷酸三鈣+原發酵培養基+缺磷營養液。(二)試驗方法：本試驗于2015年12月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。試驗用花盆(高：21cm、盆口直徑：22cm、盆底直徑：15cm)裝沙量4kg/盆(沙子處理：用水沖洗3遍，風干，pH：6.4左右，底物(磷酸三鈣)1g/kg基質)，選取長勢一致的番茄幼苗移栽于花盆中，每盆3株，置于溫室中培養，緩苗后開始試驗。試驗設置兩個處理，處理1將實施例3制備的解淀粉芽孢桿菌PHODG36菌株發酵液的稀釋液(濃度為1×107CFU/mL)300mL/盆澆灌于作物根部，處理2澆灌等量的實施例3步驟(1)制備的發酵培養基的水稀釋液為對照。期間加強番茄病蟲害管理，適時補充水分，每次500mL/盆。每5d澆一次缺磷營養液(缺磷營養液的組成成分見專利申請201110107663X)，每次300mL/盆。40d后測定番茄的株高、地上部鮮重和地下部鮮重、基質中的有效磷以及番茄植株體內磷含量等指標。表2PHODG36菌株對盆栽番茄株高和鮮重的作用試驗結果結果(見表2)接種菌株PHODG36發酵液的番茄株高增長率為64.27％，地上部鮮重增長率為26.74％，地下部鮮重增長率為42.36％，番茄株高、地上部鮮重、地下部鮮重均與空白對照之間差異顯著。上述試驗結果說明本發明解淀粉芽孢桿菌菌株PHODG36促進番茄植株生長的效果顯著。表3PHODG36菌株對基質、番茄植株有效磷的影響處理基質中磷含量(mg/kg)增長率(％)植物磷含量(mg/L)增長率(％)處理12.40126.422.5127.41處理21.06－1.97－從表3中可以看出，解淀粉芽孢桿菌菌株PHODG36對土壤中難溶性磷酸鈣具有一定的降解效果，菌株PHODG36處理后土壤中有效磷增長率為126.42％；在番茄植株磷方面，菌株PHODG36處理后番茄植株中有效磷增長率為27.41％。說明解淀粉芽孢桿菌PHODG36菌株能夠有效降解土壤中的無機磷并促進番茄植株對降解后的有效磷的吸收。實施例5解淀粉芽孢桿菌PHODG36對三種病害病原菌的抑制作用試驗(一)供試病害病原真菌來源：(1)棉花黃萎菌WX-1：分離自河北省邢臺市威縣棉花黃萎病病株，經河北農業大學鑒定為大麗輪枝菌(Verticilliumdahaliae)。(2)棉花枯萎菌FOV-1分離自河北省邯鄲市曲周縣棉花枯萎病病株，經河北農業大學鑒定為尖孢鐮刀菌棉花專化型(Fusariumoxyporiumf.sp.vasinfectum)。(3)棉花立枯菌RHS-1分離自河北省保定市高陽縣棉花苗期立枯病病株，經河北農業大學鑒定立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，上述菌株致病力測定均表現為強致病力。(二)試驗方法：本試驗于2015年11月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。首先將供試的病原真菌在PDA平板上活化培養3-7天，然后用打孔器在菌落邊緣區域打孔制成菌片，再將供試病原真菌菌片轉接在另一個PDA平板中央，接著將實施例1步驟(1)活化好的解淀粉芽孢桿菌PHODG36點接在距指示菌菌片2.0厘米處，設空白對照(不點接PHODG36菌株)。在25℃恒溫培養3-10天，逐日觀察PHODG36菌株和供試病原真菌的生長情況，待空白對照病原菌長至培養皿邊緣時，測量三種病原菌的對照生長量(菌落半徑)和處理生長量(接種PHODG36后的抑制生長半徑)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率計算公式為：抑菌率(％)＝(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100)。結果(見表4)解淀粉芽孢桿菌PHODG36對棉花黃萎菌的抑制率為73.71％，對棉花枯萎菌的抑制率為83.95％，對棉花立枯菌的抑制率為89.21％，說明解淀粉芽孢桿菌PHODG36對這三種病原菌具有明顯的抑制作用，具有防治棉花黃萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病的生防潛力。表4解淀粉芽孢桿菌菌株PHODG36對三種病原菌的抑菌作用試驗結果病原菌正常生長(mm)抑制生長(mm)抑菌率(％)棉花黃萎菌(V.dahliae)35.09.273.71棉花枯萎菌(F.oxysporum)38.06.183.95棉花立枯菌(R.solani)38.04.189.21當前第1頁1 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