一種類芽孢桿菌及其在凈化水體方面的應用的制作方法

本發明涉及水體凈化微生物，具體地說，涉及一種類芽孢桿菌及其應用。

背景技術：

隨著經濟的快速發展和城市化的加快，我國許多城市河流水質污染和生態退化問題十分突出，甚至出現了季節性和常年性水體黑臭現象。現有黑臭水體治理方式主要采用植物凈化和曝氣治理為主，凈化負荷低，治理過程需要額外電能投入，運營成本高。

芽孢桿菌是土壤中的優勢種群，能強烈地分解碳系、氮系、磷系、硫系污染物，并能分解蛋白質和復雜多糖，對水溶性有機物的分解也有重要的作用，同時可以與養殖環境中的有害藻類及水產致病菌競爭，形成優勢種群，抑制有害藻類及水產致病菌。由于它的特性與功能優于光合細菌而有望成為光合細菌的替代品，已成為當前國際凈水界研究的熱點課題。

公布號為CN103923868B的中國專利公開了一種混合菌群微生物制劑，是由類芽孢桿菌、施氏假單胞菌、假產堿假單胞菌和食油假單胞菌組成的菌懸液，總活菌數為3.8*10⁸CFU/ml以上。所述混合菌群微生物制劑可以用于處理污水，可以加強秋季人工濕地處理受污染河水及城鎮生活污水的能力。然而，所述微生物制劑依賴多種微生物的組成而發揮功能，其需要對上述多種微生物進行分離、篩選并富集培養后進行制備，工作量大，且成本較高。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種類芽孢桿菌及其在凈化水體方面的應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

第一方面，本發明提供了一種類芽孢桿菌，經鑒定為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)，編號YE-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏日期為2016年8月4日，保藏編號為CGMCC No.12814。

該菌株具有有效吸附、降解黑臭水體中有機物的功能。

本發明進一步提供了所述類芽孢桿菌YE-1在凈化水體中的應用。

第二方面，本發明提供了一種用于凈化水體的微生物菌劑，含有所述類芽孢桿菌YE-1。進一步地，所述菌劑中類芽孢桿菌YE-1的數量不小于10⁸個/mL。

第三方面，本發明提供了一種凈化水體的方法，所述方法包括如下步驟：

S1、將待凈化水體通入生物氧化反應器；

S2、將所述類芽孢桿菌YE-1富集培養后，接種至生物氧化反應器；

S3、生化反應器以室溫運行，通入空氣并進行曝氣處理，水力停留2～4小時；在這個過程中，類芽孢桿菌會在生化反應器內繁殖生長，并完成水體有機物降解過程；

S4、生物氧化反應器出水進入固液分離反應器，自然沉降完成固液分離后出水，得到凈化水體。

進一步地，所述生物氧化反應器內填料為市售硅基多孔填料。

作為優選，S2中，類芽孢桿菌YE-1的添加量相對于待凈化水體不小于2×10¹¹～4×10¹¹個/m³。

進一步地，S2中，所述富集培養的方法為將所述類芽孢桿菌YE-1接種入富集培養基中，在25～30℃的培養溫度下，100rpm搖床培養至菌液濃度達到10⁸個/mL。

作為優選，所述富集培養基的配方為：0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化鈣，0.05g/L磷酸氫二鉀，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸餾水，pH＝7.0。配置時將各成分混合均勻，調pH＝7.0，121℃下滅菌25分鐘。

所述富集培養基還可用于分離培養如上所述類芽孢桿菌，作為分離培養基時，在配置時將配方中成分混合均勻后加入30g/L結冷膠，調pH＝7.0，121℃下滅菌25分鐘后倒平板。

作為優選，本發明所述方法對COD>40mg/L、總氮>15mg/L、總磷>1mg/L的易缺氧黑臭的水體具有較佳的凈化效果。

進一步地，在利用本發明所述類芽孢桿菌YE-1處理高濃度難降解有機污水時，可以向所處理污水中復配生物營養制劑，以滿足本發明的菌種的生長需要。

更進一步地.反應器中的曝氣設施的電能供應為分布式光伏系統。與分布式光伏連用的曝氣系統可以為該菌種提供適宜的生長環境并為該菌種降解有機物供給氧氣，上述工藝流程無需額外提供電能，對黑臭水體有機物降解效率高，運營成本低，處理有效且穩定。

本發明所述的類芽孢桿菌YE-1具有對城市黑臭水體適應性強、生物穩定性好等特點。它們不僅可以有效地降低污水的COD，其最大優勢是能夠在低溫(<5℃)條件下對污水進行處理，仍然具有良好的微生物活性。在本發明的一個實施例中，利用該菌種進行生化現場實驗，裝置運行180天，微生物生長良好，系統出水穩定。

本發明的有益效果在于：

本發明新分離出一種類芽孢桿菌，可有效的吸附降解黑臭水體有機物，凈化水質。此外，與分布式光伏連用的曝氣系統可以為該菌種提供適宜的生長環境并為該菌種降解有機物供給氧氣，上述工藝流程無需額外提供電能，對黑臭水體有機物降解效率高，運營成本低，處理有效且穩定。

附圖說明

圖1為本發明所述類芽孢桿菌YE-1的掃描電鏡照片。

圖2為本發明實施例2所述的分布式光伏供電示意圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

用于分離培養上述類芽孢桿菌的培養基(簡稱：分離培養基)，配方為：

0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化鈣，0.05g/L磷酸氫二鉀，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸餾水，結冷膠30g/L。

配置時將結冷膠以外的成分混合均勻后加入結冷膠，調pH7.0，121℃下滅菌25分鐘。按上述比例配置100ml培養基，每20mL倒一塊平板。

用于富集培養上述類芽孢桿菌的培養基(簡稱：富集培養基)，配方為：0.5g/L酵母浸提物，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化鈣，0.05g/L磷酸氫二鉀，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸餾水。

配置時將各成分混合均勻，調pH7.0，121℃下滅菌25分鐘。

實施例1菌株的篩選與鑒定

1、篩選

1)在100mL含所述類芽孢桿菌泥樣中加入0.3g酵母粉，在30℃搖床100rpm輕輕震蕩富集培養1周，利用顯微鏡檢測判斷細菌生長情況；泥樣取自廣西龍江河。細菌生長至測量細菌培養液在600nm處的吸光值，得到的OD600的數值如果在0.6～0.8之間。

2)采用膜過濾將上述培養液中的細菌過濾，并將細菌用20mL無菌水洗下。以5％的接種量分別接種于多個100mL富集培養基中，45℃度進行培養，并設置不接種對照(CK)。100rpm搖床培養兩周后觀察細菌生長情況。

3)將富集培養基液梯度稀釋1、2、3、4、5(分別對應10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分別取100μL稀釋液涂布在分離培養基配制的平板上，45℃培養三天。挑單菌落進行進一步平板劃線，分離得到單菌落。挑取單菌落后，轉入新的固體培養基平板中，利用平板劃線分離法繼續進行分離培養，直至獲得單菌落。

2、鑒定

通過菌株形態觀察和理化指標分析，挑選出12株菌株進行實驗室內的黑臭水體處理實驗，實驗水體為1000mL，處理前水中氨氮為15±2mg/L、總氮為50±2mg/L和COD為300±3mg/L，實驗接菌量為2×10⁸個，25℃搖床培養15h，處理后的水質指標如表1。

表1 12株分離菌株處理黑臭水體前后水質參數(單位：mg/L)

從上表可以看出，編號為YE-1的菌株處理污水的綜合效果最佳。經YE-1菌株處理15h后，污水中化學需氧量(COD)、總氮(TN)和總磷(P)的去除率分別達到80％、80％和70％，其凈化水體的能力最強。

YE-1菌株的菌體細胞呈短桿狀，大小為2μm×1μm。革蘭氏陽性，產芽孢，芽孢為圓形或橢圓形，中生或近中生，大小為1μm。菌落圓形或近似圓形，表面粗糙扁平，稍有光澤(似蠟燭樣顏色)，菌落直徑1～2mm(如圖1所示)。

用16S rDNA克隆文庫技術分析鑒定菌種YE-1。將1mL菌液離心得到菌泥，提取總DNA，利用PCR技術以原核生物通用引物530f和1490r擴增16S rDNA片段。PCR產物純化后與Promega的T-easy載體連接，轉化大腸桿菌DH5α。挑取的白色菌落通過菌落PCR確定陽性菌落，經酶切分型，對4個克隆測序。所得序列經Blast比較表明，該菌株為Paenibacillus屬細菌，命名為Paenibacillus YE-1。

實施例2凈化水體

1、將典型黑臭水體(濟南臘山河黑臭水體)通入生物氧化反應器，該生物氧化反應器內填充市售硅基多孔填料。

該廢水水質如下：pH7.0；化學需氧量(COD)，45mg/L；總氮(TN)，15mg/L，總磷(P)，3mg/L。

2、將經鑒定的類芽孢桿菌的菌種，接種在富集培養基中25℃搖床100rpm培養至菌濃度為10⁸個/mL；然后將菌液(也可稱作菌劑，同發明內容中所述菌劑)接種至生物氧化反應器內，接種量為3L/m³。生物氧化反應器底部充空氣，曝氣量依水質不同而不同，水力停留1小時；

3、曝氣設備的電能供應為分布式光伏系統；

4、反應后出水通入固液分離反應器，靜置沉淀固液分離后出水；

5、整個反應系統連續運轉30天，出水水質分析如下：化學需氧量(COD)去除率70％，總氮(TN)去除率80％，總磷(P)去除率70％。

本發明提供的處理黑臭水體的方法，通過分布式光伏供電提供曝氣(如圖2所示)，在類芽孢桿菌菌種的吸附降解作用下，黑臭水體可獲得有效處理。

實施例3低溫下凈化水體

1、將典型黑臭水體(濟南臘山河黑臭水體)通入生物氧化反應器，該生物氧化反應器內填充市售硅基多孔填料，該廢水水質如下：pH7.0；化學需氧量(COD)，45mg/L；總氮(TN)，15mg/L，總磷(P)，3mg/L。

2、將經鑒定的類芽孢桿菌的菌種，接種在富集培養基中，5℃搖床100rpm培養至菌濃度為10⁸個/mL；然后將菌液(也可稱作菌劑，同發明內容中所述菌劑)接種至低溫環境(<5℃)生物氧化反應器內，接種量為3L/m³。生物氧化反應器底部充空氣，曝氣量依水質不同而不同，水力停留1小時；

3、曝氣設備的電能供應為分布式光伏系統；

4、反應后出水通入固液分離反應器，靜置沉淀固液分離后出水；

5、整個反應系統連續運轉30天，出水水質分析如下：化學需氧量(COD)去除率67％，總氮(TN)去除率78％，總磷(P)去除率60％。可看出該菌株在低溫下依然具有較強的黑臭水體凈化能力。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。