本發明涉及生物技術領域，具體來說是一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法及其在土壤中的應用。
背景技術：
農作物是人類賴以生存和發展的重要食品，在自然環境中易發生病蟲害，常用農藥防治，以提高農作物品質和產量。但農藥的大量使用使作物、土壤及水源受到不同程度污染，嚴重威脅環境和食品安全。目前氯氰菊酯以其殺蟲譜廣、高效、低殘留、性質穩定、安全系數高等優點，在防治農業害蟲方面具有廣泛應用；又因其應用范圍廣、接觸人群多、有蓄積性等，從而引起農殘超標、水土污染、人體中毒等現象頻發。由于氯氰菊酯理化性質比較穩定，具有耐光、熱分解，且殘留范圍廣，傳統物理化學方法處理難度大、成本高。與其他方法相比，微生物降解具有降解速度快、操作簡單、成本低、無二次污染等優點。
我國耕地自然環境復雜，污染程度差異較大。利用土著微生物，降解速度慢，降解能力不穩定，不能滿足實際要求。因此，篩選適應性強，環境友好的降解菌株是解決上述問題的根本方法。研究可進一步豐富廣譜性擬除蟲菊酯降解菌資源庫，為受氯氰菊酯污染農作物生長環境的生物修復及進一步保障其食用安全提供菌株資源和理論基礎。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法及其在土壤中的應用。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法，將氯氰菊酯降解菌接種至種子培養基，于34～40℃振蕩培養12～36h，再轉接至發酵培養基在，于34～40℃振蕩發酵培養48～72h，置于-20～-80℃冷凍處理1～8h，再于78～85℃水浴處理1～4h，3000～8000rpm離心10～30min，在無菌條件下收集菌泥復溶于0.8～1.5％NaCl溶液中，進行二次離心，3000～5000rpm離心10～30min，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護劑按照1:1～5的重量比混合均勻，-38～-42℃真空冷凍干燥后制成含菌量為0.5～2.5×1011CFU/g的菌粉；所述氯氰菊酯降解菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)BBCP-017，于2016年8月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.12886。
進一步的，所述發酵培養基配方為：胰蛋白胨0.3～1.5％、酵母浸出粉0.3～1.5％、NaCl 0.3～1.5％、MnSO4 0.01～0.25％，蒸餾水1000mL。
進一步的，所述發酵培養基的pH為6.5～7.5。
進一步的，所述凍干保護劑配方為：脫脂奶粉5～20％、葡萄糖0.5％～5％、蒸餾水1000mL。
進一步的，所述凍干保護劑pH為6.3～6.8。
本發明的另一目的是提供一種氯氰菊酯降解菌的菌粉制備方法制備的菌粉。
本發明的另一目的還提供一種氯氰菊酯降解菌的菌粉在降解土壤中氯氰菊酯的應用。
進一步的，將菌粉按質量體積百分比為0.001％～0.005％的比例復溶于無菌水或1～15％脫脂奶粉溶液中，再將菌粉懸液按照體積比1～5:100的比例添加至含氯氰菊酯的土壤中。
本發明的有益技術效果是：
1、本發明篩選氯氰菊酯降解菌的菌粉溶于無菌水后加入含60mg/L氯氰菊酯的土壤中培養7d后，降解率達89.03％；說明本發明的蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉具有環境生物修復的應用價值以及廣闊的應用前景，本發明菌粉制備工藝簡單易行，適合工業化生產，具有含活菌數量高、保質期長、使用簡單、使用量少等優點。
2、菌粉使用方便，操作簡單，只需要簡單復水或者溶解于1～15％的脫脂奶粉溶液中，就可直接使用，不需要連續擴培繁殖傳代，減少不必要的浪費；菌粉應用于田間土壤中能有效降解體系中的氯氰菊酯，是可應用于受氯氰菊酯污染環境的生物修復劑；產品性能穩定，可在4℃以下冷凍保存，保質期長達36月；在室溫條件下也可維持18月的發酵活力；同時方便運輸，適合長距離配送。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1本發明是氯氰菊酯標準曲線。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1蠟樣芽孢桿菌BBCP-017的分離、純化
②土樣處理：采自長期施用氯氰菊酯的耕地土壤，經自然風干
過80目篩備用。
②降解菌的富集馴化：取1.0g土樣加入氯氰菊酯濃度為20mg/L的基礎鹽培養基，于37℃振蕩(180rpm)培養24h后，取5％(v/v)培養液轉接至氯氰菊酯濃度為40mg/L的基礎鹽培養基中，按照上述操作連續轉接3次，培養基中氯氰菊酯濃度逐次提高至160mg/L。
③降解菌的篩選純化：馴化后，將菌液(OD600nm＝1.0)進行梯度稀釋涂布轉接到氯氰菊酯濃度為40mg/L的固體平板上，37℃培養24h，挑取單菌落于相同的固體平板連續劃線純化三代，挑選出菌落形態規則、生長速度最快的氯氰菊酯降解菌株BBCP-017；并將其保存于種子斜面，備用。
④氯氰菊酯降解菌株BBCP-017經形態、生理、分子鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)；該菌株已于2016年8月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.12886。
⑤上述培養基的配方由以下重量體積比計的組分組成。基礎鹽培養基：(NH4)2SO40.05～0.25％，KH2PO4 0.05～0.25％，K2HPO4 0.05～0.25％，MgSO4 0.05～0.25％，NaCl 0.05～0.25％，蒸餾水1000mL，pH6.8～7.5；種子培養基：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl 0.25～1.5％，蒸餾水1000mL，pH 6.5～7.5；固體培養基同液體培養基加入2.0％的瓊脂；121℃滅菌20min。滅菌后在無菌條件下加入一定體積的氯氰菊酯溶液使其為試驗所需濃度，混勻備用。
實施例2蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉的制備
①種子液制備：從實施例1中保存的種子斜面中挑取蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌落，接種于50mL種子培養基中，初始pH7.0，37℃振蕩(180rpm)培養24h，即為種子液。
②發酵培養：以5％(v/v)的接種量接種至發酵培養基中，錐形瓶裝液量為250mL/500mL，初始pH 7.0，37℃振蕩(180rpm)培養48h，結束培養。
③集菌體：將發酵培養液于-40℃冷凍處理4h，取出，再于80℃水浴處理2h，制片經孔雀綠染色，鏡檢觀察，芽孢率達95％以上；以4000rpm離心20min，在無菌條件下，去除發酵上清液，收集菌泥復溶于1％NaCl溶液中，4000rpm離心20min，除出上清液，將凍干保護劑與二次離心菌泥按1:1～5的質量比混和均勻，備用。
④真空冷凍干燥：將菌泥混合物于-40℃真空冷凍干燥12h，得到均勻的淡黃色晶體形固體。在無菌密封條件搗碎下制成蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉，置于鋁膜袋中，抽真空得成品。
⑤活化計數：取0.100g蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉復溶于100mL無菌水中，共三組平行，在無菌條件下將復溶菌粉懸液連續稀釋5次，每次三個重復，使其稀釋倍數依次為10、1×102、1×103、1×104、1×105，再分別取0.1mL稀釋液于平板中，傾注發酵培養基混勻于37℃倒置培養16h觀察菌落生長情況；最終在三組稀釋倍數為1×105的平板中平均菌落數依次為52、94、247，即本發明的蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉含菌量為0.5～2.5×1011CFU/g。
⑥凍干保護劑的配方由以下重量體積比計的組分組成：脫脂奶粉5～20％，葡萄糖0.5％～5％，蒸餾水1000mL，pH 6.3～6.8，115℃滅菌20min。
⑦發酵培養基的配方由以下重量體積比計的組分組成：胰蛋白胨0.3～1.5％，酵母浸出粉0.3～1.5％，NaCl 0.3～1.5％，MnSO4 0.01～0.25％，蒸餾水1000mL，pH 6.5～7.5，121℃滅菌20min。
實施例3蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉在耕地土壤中的應用
①氯氰菊酯的檢測及其標準曲線方程建立
高效液相色譜(HPLC)檢測：試驗為每個處理3個重復，每個重復準確稱取5.0g風干土壤，加入5mL乙腈，渦輪振蕩器振蕩至均勻后，超聲波(40kHz、100W)輔助提取60min后加入5mL的乙酸乙酯振蕩30s，靜止后取5mL上清液，過凈化柱(無水硫酸鈉∶中性氧化鋁∶活性炭＝2∶1∶1)，用10mL乙酸乙酯淋洗凈化柱，收集有機相于50℃旋轉揮干，1mL乙腈復溶；0.45μm有機濾頭過濾，HPLC待測。
檢測條件：色譜柱為Inertsil ODS-3(5.0μm，150mm×4.60mm(i.d.))，流動相為乙腈-超純水(90∶10，v/v)，流速為1.0mL/min，柱溫為25±2℃，檢測波長為210nm，進樣量為10μL。
標準曲線線性方程：配制濃度為10mg/L的氯氰菊酯標準液，上機進樣量依次為1、2、5、10、20、50μL，即質量分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg；擬合氯氰菊酯質量-峰面積的標準曲線線性方程。
實驗中氯氰菊酯降解率計算公式按下式進行：
式中，C為實驗組氯氰菊酯殘留濃度；C0為對照組中氯氰菊酯殘留濃度。
氯氰菊酯標準曲線如圖1所示，其線性方程為y＝7447784.2852x+12231.1382，其相關系數R2為0.9998，表明線性關系良好。
②田間試驗
試驗于2016年3月在成都郫縣某農作物耕地進行，土壤作物為油白菜。土壤理化性質經測定為：砂質粘土，土壤pH6.78，有機質27.90g/kg，總氮含量122.30mg/kg，總磷含量138.44mg/kg，總鉀含量85.23mg/kg。
在菜園中劃分4塊面積約為10m2的土壤，均用手動背式噴霧器噴灑氯氰菊酯濃度為10g/L的原藥液，均勻噴灑，噴灑量為100mL/m2；同時配制含菌量為1×108CFU/mL的菌粉懸液，選擇兩塊土地作為實驗組均勻噴灑菌粉懸液，噴灑量為100mL/m2。每天定時采土樣，按5點采樣法，用專用取土工具，所采土樣為耕層0～20cm，土樣混合，混合后的鮮土用四分法留取1kg，裝入聚乙烯塑料袋，標記密封；土壤經自然風干后研磨過篩保存，連續7d采用HPLC法測定對照組和實驗組的氯氰菊酯殘留量。
土壤中氯氰菊酯殘留測定結果見表1，實驗組土壤中氯氰菊酯殘留濃度遠遠低于對照組，且氯氰菊酯的降解率達89.03％，說明蠟樣芽孢桿菌BBCP-017能有效降解耕地土壤中的氯氰菊酯，對耕地土壤能起到生物修復的作用。
表1耕地土壤中氯氰菊酯的殘留量變化
本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。