一種基于吡咯雙腙的熒光探針及其制備方法與應用與流程

本發明屬于有機合成領域，具體涉及吡咯雙腙及其制備方法和應用。

背景技術：

汞離子是目前最危險及最普遍的污染物之一。汞離子很容易被人體吸收，并且不容易被排出體外，它會進入食物鏈并且在高等生物體中富集，隨后被人類攝入，作為最具毒性的金屬離子之一，汞離子在人體內聚集會對大腦、神經系統、內分泌系統和腎臟造成嚴重的損害。此外，由于汞化合物的使用范圍廣，使得汞也成為一個重要的金屬污染物。鑒于其對生命和環境的重要性，科學家們一直致力于采用熒光傳感探針實現對汞離子在生物和環境系統中檢測的研究。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種可檢測二價汞離子的靈敏度高、選擇性好的金屬離子比色探針；另一目的是提供該探針的制備方法和應用。

本發明的技術方案是，一種基于吡咯雙腙的熒光探針，所述吡咯雙腙具有如下結構式：

本發明還提供了一種基于吡咯雙腙的熒光探針的制備方法，其步驟如下：

S1：將5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯首先用無水乙醇溶解，再加入水合肼；

S2：將S1所得混合物在常壓下70-90℃回流，反應時間1-3h；

S3：將S2所得溶液冷卻至室溫后，有固體析出，減壓過濾，取濾渣；

S4：將S3所得濾渣用醇溶液洗滌，得到基于吡咯雙腙熒光探針。

所述S1中，5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯與水合肼的物質的量之比為2：1。

所述S4中醇溶液為無水乙醇或濃度為75%的乙醇溶液。

所述的基于吡咯雙腙的熒光探針的制備方法：將0.002-0.02mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于0.01-0.05L無水乙醇中，再加入0.001-0.01mol的水合肼，常壓下回流攪拌1-3h，冷卻至室溫后析出固體，減壓過濾，將濾渣用無水乙醇洗滌得到基于吡咯雙腙的熒光探針。

所述的基于吡咯雙腙的熒光探針在檢測細胞內二價汞離子中的應用。

本發明還提供了一種用于檢測細胞中二價汞離子的熒光探針，所述熒光探針主要由上述吡咯雙腙組成。

本發明提供的目標產物在重金屬離子檢測中的應用，對二價汞離子有很好的檢測效果，與現有技術相比，本發明采用的原料易得，合成步驟簡單，后處理亦很方便，較易實現大規模生產，具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強的特點，在檢測生物活體中的二價汞離子方面有很大的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明實施例1制得的基于吡咯雙腙的熒光探針的結構；

圖2為本發明實施例1制得的基于吡咯雙腙的熒光探針的核磁氫譜譜圖；

圖3為本發明實施例1制得的基于吡咯雙腙的熒光探針的質譜譜圖；

圖4為本發明實施例1制得的基于吡咯雙腙的熒光探針的乙腈/水(體積比1:1)溶液(5×10^-6 mol／L)對1當量不同金屬離子(Ag⁺，Al³⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺, Mn²⁺，Na⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，5×10^-6 mol／L)的熒光光譜圖，激發波長為350 nm；

圖5為本發明實施例1制得的基于吡咯雙腙的熒光探針的乙腈/水(體積比1:1)溶液(5×10^-6 mol／L)滴定不同濃度二價汞離子的熒光光譜圖；

圖6在U251細胞中，吡咯雙腙的熒光探針(5×10^-6 mol／L)與Hg²⁺的熒光成像圖；Hela細胞用5×10^-6 mol／L上述熒光探針培育30分鐘后加入Hg²⁺，繼續培育30分鐘后使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦顯微鏡進行熒光成像。

其中：a為上述熒光探針明場下的成像圖；b為上述熒光探針熒光成像；c為上述熒光探針明場圖和熒光圖疊加后的圖片；d為上述熒光探針+Hg²⁺明場下的成像圖；e為上述熒光探針+HgCu²⁺熒光成像圖；f為上述熒光探針+HgCu²⁺明場圖和熒光圖疊加后的圖片。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明，本發明實施例采用的試劑和原料為常規市場購買或參考文獻合成得到。

實施例1：

吡咯雙腙的合成

將0.39g5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于10mL無水乙醇中，再加入0.06 g85%水合肼，常壓下78℃回流攪拌1h，冷卻至室溫后析出大量固體，減壓過濾，將濾渣用無水乙醇洗滌得到淡黃色固體即為目標產物，目標產物的產率為85%。

單晶結構：吡咯雙腙熒光探針乙醇溶劑合物的晶體結構圖見圖1；

核磁：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆), δ (ppm): 11.74 (s, 2H, 2NH), 8.45 (s, 2H, 2CH=N), 4.16-4.21 (q, 4H, 2CH₂), 2.45 (s, 6H, 2CH₃), 2.33 (s, 6H, 2CH₃),1.26-1.30 (t, 6H, 2CH₃).具體核磁譜圖見圖2；

質譜：ESI-MS: m/z = 387.1938 for [M+H]⁺.具體質譜譜圖見圖3。

實施例2

所述的基于吡咯雙腙的熒光探針的制備方法：將0.002mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于50 ml無水乙醇中，再加入0.01mol的水合肼，常壓下70℃回流攪拌3h，冷卻至室溫后析出固體，減壓過濾，將濾渣用無水乙醇洗滌得到基于吡咯雙腙的熒光探針。

實施例3

所述的基于吡咯雙腙的熒光探針的制備方法：將0.02mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于20 ml無水乙醇中，再加入0.01mol的水合肼，常壓下80℃回流攪拌2h，冷卻至室溫后析出固體，減壓過濾，將濾渣用無水乙醇洗滌得到基于吡咯雙腙的熒光探針。

實施例4

所述的基于吡咯雙腙的熒光探針的制備方法：將0.02 mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于30 ml無水乙醇中，再加入0.001 mol的水合肼，常壓下90℃回流攪拌1h，冷卻至室溫后析出固體，減壓過濾，將濾渣用無水乙醇洗滌得到基于吡咯雙腙的熒光探針。

吡咯雙腙對二價汞離子的熒光性質測定

將上述制得的吡咯雙腙作為熒光探針在乙腈/水(體積比1：1)介質中配制成摩爾濃度為5×10^-6 mol／L的溶液，分別在含摩爾濃度為5×10^-6 mol／L的Ag⁺，Al³⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺，Ni²⁺, Pb²⁺，Zn²⁺等金屬離子的溶液中加入等量的上述熒光探針溶液，其中，Hg²⁺能夠與吡咯雙腙熒光探針反應產生藍色熒光，具體見圖4。

濃度為5×10^-6 mol／L的吡咯雙腙作為熒光探針的乙腈/水(體積比1：1)溶液中分別加入濃度為0 mol／L，1×10^-6 mol／L，2×10^-6 mol／L，3×10^-6 mol／L，4×10^-6 mol／L，5×10^-6 mol／L，6×10^-6 mol／L，7×10^-6 mol／L，8×10^-6 mol／L，9×10^-6 mol／L，1×10^-5 mol／L的二價汞離子，采用熒光分光光度計對其分別進行熒光光譜分析（激發波長為350 nm），記錄475 nm處的熒光強度值，所得的熒光光譜圖見圖5。通過附圖5可以看出，隨著二價汞離子濃度增加，吡咯雙腙熒光探針在475 nm處的熒光發射逐漸增強，且發射峰強度與汞離子濃度在0-5×10^-6 mol／L范圍內線性相關，檢測限為1.02×10^-7 mol／L。

吡咯雙腙作為熒光探針在細胞內汞離子的檢測實驗

U251細胞用5×10^-6 M的上述羅丹明6G衍生物作為熒光傳感器培育5小時后加入Hg²⁺，繼續培育5小時后使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦顯微鏡進行熒光成像，獲得在U251細胞的熒光成像圖，具體如圖6所示，其中a為上述熒光傳感器明場下的成像圖；b為上述熒光傳感器熒光成像圖；c為上述熒光傳感器明場圖和熒光圖疊加后的圖片；d為上述熒光傳感器+Cu²⁺明場下的成像圖；e為上述熒光傳感器+Cu²⁺熒光成像圖；f為上述熒光傳感器+Cu²⁺明場圖和熒光圖疊加后的圖片。U251細胞中加入上述吡咯雙腙幾乎不產生熒光，而再加入二價汞離子后，熒光強度明顯增加。故本發明制得的吡咯雙腙可用于細胞中二價汞離子的熒光探針。

以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，其保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內，本發明的保護范圍以權利要求書為準。