一種優化的pBBR1MCS系列載體及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，涉及一種廣宿主的表達載體的構建。

背景技術：

pBBR1MCS系列載體包括pBBR1MCS、pBBR1MCS2-5等一系列廣宿主載體，這類載體可以在多種宿主中復制，像Acetobacter xylinum，Alcaligenes eutrophus，Bartonella bacilliformis，Bordetella spp.，Brucella spp.，Caulobacter crescentus，Escherichia coli，Paracoccous denitrificans，Pseudomonas fluorescens，Rhizobium meliloti，Rhodobacter sphaeroides，Vibrio cholerae，Xanthomonas campestris等。這些載體的共同特征包括：(1)載體大小較小(﹤5.3kb)，可以插入的外源片段較大；(2)擁有一個擴展的多克隆位點(MCS)，(3)含有LacZα短肽編碼基因，可以利用α互補直接篩選插入了外源片段的重組子，(4)可以與包括IncP,IncQ和IncW等在內的多種不兼容群的質粒兼容。

但是，Sonja等人(2013)的研究發現，若利用pBBR1MCS系列載體表達外源基因，因為表達的外源蛋白的N端同β-半乳糖苷酶α端的大約20個短肽融合表達，可能會影響目的蛋白的活性。因此，若要將此系列載體應用于外源基因的表達，需要對其表達元件進行改造。

技術實現要素：

本發明需要解決的問題是克服pBBR1MCS系列載體的缺陷，提供一種優化的pBBR1MCS系列載體，將該載體的LacZα短肽編碼基因、lac啟動子替換成來源于pGEX4T-1的tac啟動子，使該載體更適用于基因的表達，目的基因可以用IPTG誘導表達且N端不含β-半乳糖苷酶α端的短肽，該載體的LacZα表達相關的終止序列可以被替換成pGEX4T-1的終止序列，也可以不用替換。

本發明提供的優化的表達載體構建流程如下：利用PCR技術分別擴增來源于pGEX4T-1的包括Ptac啟動子和調控序列LacIq的片段Ptac、終止序列Ter和來自pBBR1MCS系列載體的多克隆位點MCS，其中，MCS位點在設計引物時引入了Bgl II酶切位點；利用融合PCR技術將Ptac、Ter和MCS序列融合，獲得表達元件PMT，在設計PMT片段引物時兩端分別引入Kpn I和Sac I酶切位點；利用PCR擴增得到pBBR1MCS系列載體上除lac啟動子、LacZα編碼序列、MCS及終止序列以外的骨架結構pMCS，設計引物時PMCS兩端分別引入Kpn I和Sac I酶切位點；利用Kpn I和Sac I對表達元件PMT和骨架結構pMCS進行酶切后利用Takara公司的連接試劑盒進行連接，獲得改造的表達載體pBBRtac。

同原有質粒相比，優化載體的多克隆位點引入了Bgl II的酶切位點，便于基因的克隆和功能鑒定。

本發明構建的表達載體為pBBRtac系列載體，即pBBRtac，pBBRtac2-5。

本發明構建的廣宿主載體pBBRtac采用Ptac啟動子，同Plac啟動子相比，該啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，轉錄水平更高，更有利于目的蛋白的表達，同時，去除了N端融合的20個左右氨基酸的β-半乳糖苷酶α端的短肽將有利于外源蛋白的正確折疊，使其形成有活性的蛋白，這非常有利于目標基因在多種宿主中的高效表達。

本發明構建的廣宿主載體已成功應用于大腸桿菌中。

附圖說明

圖1市售pBBR1MCS3質粒圖譜

圖2 pBBRtac3質粒圖譜

圖3 UgpG表達的SDS-PAGE分析

具體實施方式

實施例1pBBRtac3載體構建

本發明以廣宿主載體pBBR1MCS3為改造模板，將該載體的LacZα編碼基因、lac啟動子替換成來源于pGEX4T-1的tac啟動子，使其適用于外源基因的表達，該載體的LacZα表達相關的終止序列可以被替換成pGEX4G-1的終止序列，也可以不用替換，本實施例中將pBBR1MCS3終止序列替換成pGEX4T-1的終止序列。同時，對該載體的多克隆位點進行改造，引入了Bgl II的酶切位點，得到重組質粒pBBRtac3。

pBBRtac3的設計思路和技術路線如下：

1.PCR擴增包含tac啟動子和調控序列lacIq的片段Ptac以及終止序列Ter

以質粒pGEX-4T-1(GenBank No.U13853)為模板，根據基因的序列，利用primer5.0設計引物并擴增包含tac啟動子和lacIq調控序列的片段Ptac以及終止序列Ter。設計引物序列為:Ptac-F：GATAACCGTATTACCGCCTTTG(SEQ ID NO.1)

Ptac-R：TCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAA(SEQ ID NO.2)

Ter-F：GCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTTCGGT(SEQ ID NO.3)

Ter-R：CGCGTTATTGAAGCATTTATCAGGGT(SEQ ID NO.4)

使用的酶是Takara公司高保真的HS DNA Polymerase，PCR反應條件為：95℃5min；95℃45s；50℃/55℃45s；72℃2.5min/30s，30個循環；72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

2.PCR擴增pBBR1MCS-3的多克隆位點MCS片段

以pBBR1MCS-3為模板，以MCS-R和MCS-F為引物，利用購自Takara公司的 HS DNA Polymerase，采用常規PCR方法擴增多克隆位點MCS片段，序列如SEQID NO.7所示。在設計引物時去掉了原有的Kpn I和Sac I位點，引入了Bgl II的酶切位點(下劃線部分)。測序結果表明，該多克隆位點既包含了原質粒上的的Xho I、Sma I、Spe I等酶切位點，同時也成功引入了酶切位點Bgl II。

SEQ ID NO.5：

CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTT

設計引物如下：

MCS-F：CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC(SEQ ID NO.6)

MCS-R：AAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCG(SEQ ID NO.7)

PCR反應條件：95℃5min；95℃45s；55℃45s；72℃30s，30個循環；72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

3.融合PCR構建表達元件PMT

該過程通過兩步來實現。第一步，融合PCR。在設計擴增Ptac、MCS和Ter片段的引物時，分別引入了同相鄰片段重疊的序列，這些序列可以作為融合PCR的引物，并且，通過計算使PCR體系中各片段的摩爾濃度一致。PCR體系(25μL)為：2×GC Buffer 12.5μL，dNTP 2μL， HS DNA Polymerase 0.4μL，MCS 2.8μL，Ptac 5.6μL，Ter 1.7μL，PCR反應條件：95℃5min；95℃45s，65℃2.5min，72℃3.5min，25個循環；72℃10min。

第二步，巢氏PCR。以融合PCR產物為模板，以PMT-F和PMT-R為引物進行巢氏PCR擴增，條件如下：95℃5min；95℃45s；60℃45s；72℃2.5min，30個循環；72℃10min。

引物序列如下：

PMT-F:AGGGGTACCATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAAC(SEQ ID NO.8)

PMT-R:CGGCCGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTT(SEQ ID NO.9)

4.PCR擴增pBBR1MCS-3質粒的骨架pMCS-3

以pBBR1MCS-3(GenBank No.U25059)為模板，以pMCS3-F和pMCS3-R為引物，利用HS DNA Polymerase擴增pBBR1MCS-3質粒上除lac啟動子、LacZα編碼序列、MCS及終止序列的骨架結構片段pMCS-3，PCR反應條件：95℃5min；95℃45s；60℃45s；72℃5min，30個循環；72℃10min。

引物序列如下：

pMCS3-F:GCGGCGAGCTCTTGTAAGCGTTAATATTTTG(SEQ ID NO.10)

pMCS3-R:ACGGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGC(SEQ ID NO.11)

5.pBBRtac3表達載體構建

將PMT片段和pMCS片段分別進行切膠回收，利用限制性內切酶Kpn I和Sac I對純化后的片段進行雙酶切，經1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，回收后的片段利用Takara的連接試劑盒進行連接，連接體系為：pMCS3片段3μL，PMT片段6μL，Solution I 9μL，16℃過夜連接。將連接產物加入氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5α感受態細胞，冰浴30min，42℃水浴熱激90s，快速置于冰上1-3min。加入新鮮LB培養基800μL，于37℃振蕩培養45min。取200μL菌液涂布于含有終濃度為12.5μg/ml四環素的LB固體培養基上，37℃培養至有單菌落出現。挑取單菌落至含有四環素的LB液體培養基中，37℃振蕩過夜培養，根據天根質粒提取試劑盒操作說明提取質粒。以質粒為模板，設計兩對引物PMT-F-in、PMT-R-in和SacI-F、SacI-R分別進行PCR反應，同時，采用Kpn I和Sac I雙酶切的辦法對質粒加以鑒定。將鑒定正確的質粒送往上海生工生物公司測序，所得的質粒命名為pBBRtac3，序列如SEQ ID NO.12所示。其中，3019-5464位為PMT序列。

SEQ ID NO.12

CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATA CTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGGGTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAAGCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAACCCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAGACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCCCGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTTGCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGC CTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAATACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATAACGTAATTCCAACGCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTCCTGTAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTGACCGTAATGGGATAGGTTACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGACGACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGT CTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCGGAATGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCATTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATG CAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT

引物序列：

PMT-F-in：ACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGC(SEQ ID NO.13)

PMT-R-in：GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG(SEQ ID NO.14)

SacI-F：GGTGATGACGGTGAAAACCTCTG(SEQ ID NO.15)

SacI-R：CGGCACCTCGCTAACGGATTCACC(SEQ ID NO.16)

實施例2：載體pBBRtac3在大腸桿菌中表達檢測

本實施例以鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.WG，保藏號為CCTCC No:M2013161)中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UgpG(GenBank No.KTF67651)基因在大腸桿菌中的表達為例，驗證載體的有效性。所用引物序列如下：

UgpG-F:GCTCTAGAATGACGATCAAGCCGCTGCG(SEQ ID NO.17)

UgpG-R:GAAGATCTTCAACCGAGCGCACGC(SEQ ID NO.18)

1.重組表達載體及重組菌株的構建

以UgpG-F和UgpG-R為引物，以鞘氨醇單胞菌基因組為模板擴增UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpG片段，分別利用Xba I和Bgl II對該片段和pBBRtac3進行雙酶切，經1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，回收后的片段利用Takara的連接試劑盒進行連接，連接體系為：目的片段4μL，載體12μL，Solution I 16μL，16℃過夜連接。將連接產物轉化氯化鈣法制備 的大腸桿菌DH5α感受態細胞，冰浴30min，42℃水浴熱激90s，快速置于冰上1-3min。加入新鮮LB培養基800μL，于37℃振蕩培養45min。取200μL菌液涂布于含有終濃度為12.5μg/ml四環素的LB固體培養基上，37℃培養至出現單菌落。挑取單菌落至含有四環素的LB液體培養基中，37℃振蕩過夜培養，根據天根質粒提取試劑盒操作說明提取質粒。以提取的質粒為模板，以UgpG-F和UgpG-R為引物進行PCR反應，同時，采用XbaI和BglII雙酶切的辦法對質粒加以鑒定。將鑒定正確的質粒送往上海生工生物公司測序，表明UgpG片段已經連接至該載體，所得的重組質粒命名為pBBRtac-UgpG。

將該質粒采用相同的方法轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取四環素平板上的單菌落，得到UgpG的表達菌株。

2.UgpG蛋白的誘導表達

將獲得的表達菌株接種到10mL的LB培養基中活化后，轉接至50mL新鮮的LB液體培養基中，37℃培養至OD₆₀₀＝0.6-0.8時，加入一定量的100mmol/L的IPTG使其終濃度為0.2mmol/L進行誘導，28℃誘導6h后停止培養。8,000rpm離心10min收集菌體，去離子水洗滌菌體兩次，并將菌體重新懸浮于pH 7.2的PBS緩沖液中，進行超聲破碎，超聲破碎程序設定為超聲2s、停5s，全程時間15min，功率＜400。將破碎后的樣品8,000rpm離心25min，收集上清，進行SDS-PAGE分析。整個過程均以未轉化質粒的大腸桿菌BL21(DE3)宿主作為對照。

3.蛋白表達的SDS-PAGE

在20μL待檢測樣品中加入5μL的5×Loading Buffer，混勻，在100℃水浴中煮沸5min后離心，取上清進行SDS-PAGE電泳，采用12％的分離膠和5％的堆積膠。附圖2即SDS-PAGE分析結果，同對照相比，在37kDa處有顯著的條帶，大小與預期相符，應該為目的條帶，證明UgpG為可溶性表達。