NRAS基因突變檢測試劑盒的制作方法

本發明涉及一種試劑盒，具體涉及一種腫瘤相關基因NRAS基因突變檢測試劑盒。
背景技術：
：NRAS基因是RAS癌基因家族的成員，定位于1號染色體，基因全長85kb，哺乳動物RAS基因家族包括c-Hras1、c-K-ras2及N-ras基因。ras基因家族編碼含188-189個氨基酸殘基，分子量為21KD的蛋白即P21蛋白，其氨基酸序列高度保守，僅有C末端40個氨基酸的差異。RAS蛋白具有GTP/GDP結合的能力及GTP酶活性，它們的正常功能為G蛋白類似的調節蛋白，具有從膜結合受體到腺苷酸環化過程的信號傳導作用，參與細胞周期的正常調控。RAS基因活化主要是通過（1）編碼區內的點突變；（2）插入激活；突變激活RAS基因家族主要是以點突變為主。突變的RAS蛋白失去內在的GTP酶活性使ras蛋白維持于活化狀態，不斷激活靶分子，引起信號傳導的持續效應，導致細胞大量增殖，從而發生惡性轉化。目前研究表明，N-ras基因突變在ras基因突變中出現的頻率最高，以第12、13、61或146密碼子突變最為常見，其常見突變位點有Codon12:G12A,G12C,G12D,G12R,G12S,G12V；Codon13:G13A,G13C,G13D,G13R,G13S,G13V；Codon61:Q61E,Q61H,Q61K,Q61L,Q61P,Q61R；Condon146：A146K。N-ras突變主要發生于骨髓增生異常綜合癥（MDS)、黑色素瘤、肝癌、急性髓系白血病（AML）等。國外研究發現RAS基因突變在MDS檢出率可達20%-50%不等，ras基因突變與MDS預后的關系密切相關，這種預后關系現在研究傾向與該基因突變與MDS進展為AML密切相關，基因突變導致基因組的不穩定，導致預后差及生存期短。PaduaRA,GuinnBA10等通過對75名MDS患者進行10年隨訪研究發現ras基因突變率為36%，攜帶ras基因突變者向急性白血病轉化的風險較陰性者顯著提高。FernandezT等采用聚合酶鏈反應-寡核苷酸探針雜交技術分析了巴西人群50例MDS患者發現21例患者存在N-ras基因點突變（42%），其中9例發展為急性白血病，對N-ras基因點突變和染色體異常相關性分析發現8號染色體三體可能和N-ras基因點突變相關，這部分病人在隨訪過程中均進展為急性髓系白血病。FenauxP等認為10%的MDS患者在診斷初即可表現為N-ras基因突變陽性，30%-40%的患者隨著疾病進展出現N-ras基因突變。N-ras基因在惡性黑色素瘤中的突變率為13%-25%，NRAS基因與黑色素瘤細胞增殖的相關性，隨著黑色素瘤細胞的增殖，細胞內NRASmRNA和蛋白表達量均顯著提高。研究證明攜帶N-ras或V600BRAF基因突變的晚期黑色素瘤患者可以從BRAF抑制劑治療中獲益。然而，對于BRAF野生型腫瘤患者（包括攜帶NRAS變異基因的患者）來說就不存在靶向治療。意大利國立腫瘤研究機構的PaoloAAscierto等針對上述問題進行了相關研究，他們的Ⅱ期臨床試驗研究發現，對于N-ras基因變異的黑色素瘤患者，一種小分子MEK1/2抑制劑——MEK162是第一個有效的靶向治療藥物，且可能為幾乎無有效治療方法的癌癥患者提供一種新的治療選擇。NRAS基因突變的檢測主要有Sanger測序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技術采用等位基因特異性擴增法對樣本的基因突變進行區分，該方法成本較低，但檢測率較高，容易出現假陰性結果；ARMS技術是目前國內應用最為廣泛的技術，但只能檢測已知的位點，且要將樣本分成多個管進行實驗才能實現分型，對樣本量要求高；而Sanger測序法是DNA序列分析的經典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型的金標準，其主要優點是測序長度較長，可發現新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失。所以探索一種Sanger測序法檢測NRAS基因的技術具有重要的臨床意義。技術實現要素：本發明的目的是為了解決上述問題，提供一種NRAS基因突變檢測試劑盒，可直接利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過Sanger測序法檢測出樣本中NRAS基因主要突變位點型別，檢測位點包括NRAS基因2、3和4三個外顯子的主要突變位點，包括但不限于2號外顯子上c.34G>A，p.G12S突變位點；3號外顯子上c.181C>A，p.Q61K突變位點；4號外顯子上c.436G>A，p.A146T突變位點。本發明的NRAS基因突變檢測試劑盒具體包括：（1）用于擴增樣本中NRAS基因Exon2、3和4三個外顯子的特異性引物，具體序列如下:（2）用于測序PCR的測序引物，分別用于對NRAS基因2、3和4三個外顯子進行測序分析，具體序列如下：外顯子名稱序列號Reverse5’-3’2SEQ-N2SEQIDNo.7TAGATGTGGCTCGCCAATTAAC3SEQ-N3SEQIDNo.8TGCATTCCCTGTGGTTTTTAAT4SEQ-N4SEQIDNo.9CCCAGCCTAATCTTGTTTTTCT（3）3個裝有NRAS野生型質粒和突變型質粒按1:1質量比例混合的陽性質控品管和1個裝有PCR反應預混液的試管；其中突變型質粒分別是2號外顯子上c.34G>A，p.G12S突變位點；3號外顯子上c.181C>A，p.Q61K突變位點；4號外顯子c.436G>A，p.A146T突變位點；PCR反應預混液由以下組份組成：組份體積（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本試劑盒主是根據NRAS基因2、3和4三個外顯子的保守序列分別設計NRAS基因三個外顯子的特異性引物，分別將Exon2、3和4三個外顯子使用PCR的方法進行擴增，純化回收擴增產物。本發明的各種引物長度在20-25個堿基之間，無特殊修飾。反應液預混液采用獨特的配方及比例。不同外顯子的PCR擴增條件一致，且能在樣本濃度較低時檢測到目的基因，結果無非特異性擴增。具體操作流程包括：（1）引物設計：利用引物設計軟件，如PrimerPremier5，從NRAS基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據堿基互補特點，設計NRAS基因2、3和4三個外顯子的特異性引物，用于擴增樣本中DNA。測序引物的設計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNOs：1-9。長度在20-25個堿基左右（2）PCR擴增：利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴增臨床樣本中的DNA。（3）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收：將擴增得到的目的基因NRAS基因2、3和4三個外顯子片段回收用于測序。附圖說明以下是附圖的說明，以便于理解上述發明的目的和具體特征。圖1為NRAS基因的Exon2、3和4三個外顯子的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖1中各標號的具體表示如下：2：NRAS基因第2號外顯子；3：NRAS基因第3號外顯子；4：NRAS基因第4號外顯子；M：DNAmaker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、250和100。圖2-1為NRAS基因的Exon2外顯子的測序結果截圖，測序結果為野生型。圖2-2為NRAS基因的Exon2外顯子的測序結果截圖，測序結果為突變體。圖2-3為NRAS基因的Exon3外顯子的測序結果截圖，測序結果為野生型。圖2-4為NRAS基因的Exon3外顯子的測序結果截圖，測序結果為突變體。圖2-5為NRAS基因的Exon4外顯子的測序結果截圖，測序結果為野生型。圖2-6為NRAS基因的Exon4外顯子的測序結果截圖，測序結果為突變體。具體實施方式1、引物設計根據NRAS基因在結直腸癌等疾病中的突變情況及個體化治療后產生的耐藥機制，利用引物設計軟件，如PrimerPremier5，從NRAS基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據堿基互補特點，設計NRAS基因Exon2、3和4三個外顯子的特異性引物，用于擴增樣本中DNA。引物序列分別是SEQIDNos：1-6。測序引物的設計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNos：7-9。長度在20-25個堿基。2、PCR擴增2.1、質控品準備陽性質控品為NRAS野生型質粒和突變型質粒按1:1質量比例混合的混合物，陰性質控品為無菌水。使用前室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。2.2、試劑配制提前將試劑取出，室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。確定反應數N，N=待檢樣本數（n）×3+質控品數+1。計算加到反映混合物中的各個試劑的量，計算如下：組分PCRmix3（即PCR反應預混液）Taq酶體積（μl）19.75×N0.25×N取一個滅菌離心管配制上述反應體系，試劑全部加入后旋渦振蕩10秒，瞬時離心。然后將上述混合液按20μl/管分裝至PCR反應管中。2.3、加樣將NRAS陽性質控品、陰性質控品和樣本DNA分別取2.5μl加入到PCR反應管中，其中樣本要稀釋至20ng/μl；然后再將相應的引物加入到對應的PCR反應管中，每個樣本需要引物各加1.25μl，同時作好標記，蓋緊管蓋后，瞬時離心15秒，將管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復離心至氣泡完全消除。然后立即進行PCR擴增反應。2.4、PCR擴增配置完成后，將PCR管放入PCR儀進行反應，PCR反應程序如下：3、PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及回收由于PCR產物長度較短，配制2%（w/w）的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統拍照，并記錄擴增條帶情況。如果PCR產物電泳結果良好，即可回收目的片段用于測序。回收得到的產物即可用于測序。序列表<110>廣州凱普醫藥科技有限公司<120>NRAS基因突變檢測試劑盒<160>9<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-F<400>1tagatgtggctcgccaattaac22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-R<400>2gaatatgggtaaagatgatccgac24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-F<400>3tgcattccctgtggtttttaat22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-R<400>4cctttcagagaaaataatgctcct24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-F<400>5cccagcctaatcttgtttttct22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-R<400>6cacaaatgctgaaagctgtacc22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N2<400>7tagatgtggctcgccaattaac22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N3<400>8tgcattccctgtggtttttaat22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N4<400>9cccagcctaatcttgtttttct22當前第1頁1 2 3