一株脫氯艾德昂菌及其應用的制作方法

本發明屬于微生物領域，涉及一株脫氯艾德昂菌及其應用，該脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)FZJG233能將空氣中游離的氮轉為氨對大麥有著明顯的促生作用及對水稻稻瘟病菌具有拮抗作用，可以抑制水稻稻瘟病菌的發生。

背景技術：

內生固氮菌是一類具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人們在研究內生固氮菌時發現某些菌類能提供植物高達70%的氮量。發掘內生固氮菌的資源已成為非豆科作物高效利用生物固氮戰略的主攻方向之一。長期以來，為了確保農產品獲得高產，人們大量使用化學肥料和農藥，這樣既造成了土壤結構的破壞及環境的污染，又不利于農業的可持續發展。通過微生物的作用將空氣中游離的氮轉為氨，供植物吸收利用，從而促進作物的生長。

從福建農林大學菌草所基地巨菌草根中篩選到具有高固氮酶活性的脫氯艾德昂菌菌株，通過將空氣中游離的氮轉為氨，供植物吸收利用，從而促進作物生長具有重要的意義。水稻稻瘟病是危害水稻最為嚴重的三大病害之一，可引起大幅度減產，嚴重時減產40%~50%，甚至顆粒無收。該菌株具有拮抗稻瘟病病菌，從而抑制水稻稻瘟病的作用。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一株脫氯艾德昂菌及其應用，提供具有高效固氮酶活性、生長速度快、對環境適應性強的內生固氮菌株。通過菌株將空氣中游離的氮轉為氨，供作物吸收利用，從而能夠顯著促進大麥等作物生長的菌株。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明通過采用選擇性培養基在厭氧和好氧培養條件下，利用CCM與NFB兩種選擇性無氮培養基從福建農林大學菌草所基地巨菌草根中進行內生固氮菌的分離純化。將分離純化到的內生固氮菌株進行活化后，用乙炔還原法和¹⁵N₂同位素標記，固氮酶活性為351.21nmol.mL^-1h^-1，15N測定豐度為26.55%，發現該菌株能夠將空氣中游離的氮轉為氨，可作為促生劑對大麥具有明顯的促生長用。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

本發明所述的巨菌草固氮菌為艾德昂菌(Ideonella sp. ) FZJG233，已于2016年01月21日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號為 CGMCC No.12059。地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所。

本發明脫氯艾德昂菌具有如下形態和生理、生化特性：

a、菌體形態特性

該脫氯艾德昂菌為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，大小為(0.6-0.8)×(1.1-1.6) ∽μm。

b、菌落形態特性

LB瓊脂平板上生長速度較快，菌落圓形（28.5 ℃，生長48小時），表面光滑呈粘液狀，邊緣整齊，乳白色，菌落直徑4-9毫米。最適生長溫度是25-37℃及最佳生長pH值7.0。

c、生理生化特性

以糊精、 D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、水蘇糖、棉籽糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇

D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉SV 、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、林肯霉素、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸內酯、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘液酸、奎寧酸、糖質酸、萬古霉素、四唑紫、四唑藍、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸為碳源的代謝為陽性；以D-絲氨酸、α-酮-戊二酸、亞碲酸鉀、α-羥基-丁酸、α-酮-丁酸、丙酸、甲酸、溴酸鈉 為的碳源的代謝為陰性；pH生長可耐pH5-pH6；耐NaCl的濃度可達8%；明膠液化為陽性；觸酶反應為陽性；水解淀粉為陽性；革蘭氏染色為陽性；溶解無機磷的能力為陽性；對稻瘟病菌具有一定的拮抗力。

該菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明具有高效固氮酶活性菌株FZJG233的分子分類地位的確定：

采用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進行擴增，將PCR產物直接進行序列測定，將獲得的16S rDNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發明的菌株FZJG233在分類學中的種、屬的位置。結果發現本發明的菌株FZJG233，與脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans )模式菌株NR0261081相似性為99%。16S rRNA基因序列分析，本發明的脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans.)應歸屬于脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)。

本發明菌種的分離純化方法如下：

將生長于福建農林大學菌草所基地巨菌草的根用蒸餾水洗凈，剪下長度3-5cm根置于滅菌的培養皿中，用3%的雙氧水(H₂O₂)浸泡4min（以除去根、莖、葉表面的腐爛物質），無菌水洗滌一次，再用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的HgCl₂浸泡3min，無菌水洗滌7次，每次5-10 min，并將最后一次洗滌液涂布于固體培養基，以檢測消毒是否徹底。將表面消毒完全的根用滅菌剪刀剪碎，分別用滅菌鑷子夾入到3支裝有NFB半固體培養基的試管中，膠塞密封后，至于28℃的細菌培養箱內進行培養。待試管中長出菌體后，向管內注入1/10體積10%乙炔氣體（終濃度為1%），24 h后，測定固氮酶活性（乙炔還原法）。將具有固氮酶活性的菌株從半固體管中接至相應的固體培養基上，平板劃線分離，28℃，濕度為85％條件下，進行厭氧及好氧培養。再挑取單菌落分別接種至半固體培養基試管中，以檢測固氮酶活性，再涂平板直到獲得純的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態及確定純化與否。純化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。

NFB培養基構成: malic acid(蘋果酸) 5.0 g/L，K₂HPO4 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，0.5% bromthymol blue 2.0 mL/L(先溶解在0.2 N KOH溶液中)，vitamin solution(維生素液) 1.0 mL/L，micronutrient solution(微量元素液) 2.0 mL/L，1.64% Fe-EDTA solution 4.0 mL/L，KOH 4.5 g/L，pH=6.8。其中vitamin solution(維生素液)組成為：biotin(生物素)100.0 mg/L，pyridoxol-HCl(鹽酸吡哆醇，維生素B6) 200.0 mg/L; micronutrient solution(微量元素液)組成為：CuSO₄0.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.12 g/L，H₂BO₃ 1.4 g/L, Na₂MoO₄·2H₂O 1.0 g/L，MnSO₄ 1.5 g/L(固體培養基中加入1.7wt.%的瓊脂，半固體培養基中加入0.15-0.25 wt.%的瓊脂)。

本發明的菌種可作為促生劑以促進大麥及禾本科作物生長。如可將分離純化得到的單菌落采用LB液體培養基于28℃培養48小時，菌液OD600值達0.6時濃度為6×10⁸cfu /mL 的菌液,以接種同樣體積的清水的為對照，每盆大麥澆灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次， 15天后與未接種的對照相比，大麥的葉長、根長、鮮重、根重都達到了明顯差異，對大麥有明顯的促生作用。

制備濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液的制備過程為：取5mL 培養24h 后的內生菌菌液在12000r/min，10min 的條件下離心，用去離子水清洗后再離心，然后將收集的菌體懸浮于0.03M MgSO4 溶液中，并稀釋至所測OD600 為0.6，即得對應濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液。

本發明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發生。

取10μl 過夜培養的內生菌菌液滴于PDA培養基的中部，切取0.3 cm×0.3cm 大小培養3-5d 的稻瘟病原菌菌塊于PDA 培養基邊緣一側，28℃培養1-2d 后，每個培養皿3 種稻瘟病菌，進行對峙培養，每個重復3 次。培養3-5d 后進行結果觀察，內生菌FZJG233對水稻稻瘟病病原菌具有強拮抗作用。

（三）接種及抑菌效果

本發明為一株具有高效固氮酶活性的脫氯艾德昂菌。它來源于福建農林大學菌草所基地巨菌草根部，能夠固定空氣中的氮氣，對大麥具有明顯的促生長作用。

本發明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發生。

本發明的優點在于：本發明提供具有高效固氮酶活性、生長速度快、對環境適應性強的內生固氮菌株。通過菌株將空氣中游離的氮轉為氨，供作物吸收利用，從而能夠顯著促進大麥等作物生長的菌株。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

附圖說明

圖1 接種脫氯艾德昂菌(Ideonella sp. )FZJG233促進大麥生長，

CK為未接種脫氯艾德昂菌菌株大麥苗，FZJG415為接種脫氯艾德昂菌菌株FZJG233。

圖2脫氯艾德昂菌(Ideonella sp. )FZJG233抑菌的產生。

具體實施方式

通過下面給出的本發明的具體接種例可以進一步清楚地理解本發明。應理解此接種例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

實施例1

菌株的分離鑒定的過程如下：將采集的生長于福建農林大學菌草所基地巨菌草的新鮮根樣本用蒸餾水洗凈，然后剪下根、莖、葉并分別置于已滅菌的三個培養皿中，用3%的雙氧水(H₂O₂)浸泡4min以除去根、莖、葉表面的腐爛物質，無菌水洗滌一次，再用0.1%的升汞(HgCl₂)浸泡5min，無菌水中振動洗滌5次，每次5-8min。將表面消毒完全的根、莖、葉用已滅菌手術刀切碎，分別接種到三支裝有5ml NFB半固體培養基的試管中，膠塞密封后，置于28℃的人工培養箱內進行培養。整個操作均在無菌條件下完成。待長出菌體后，向管內注入1/10體積10%乙炔氣體（終濃度為1％），在相同條件下再培養24 h，用乙炔還原法測定其固氮酶活性。將具有高固氮酶活性的菌株從半固體管中接至相應的固體培養基上，平板劃線分離，28℃，濕度為85％條件下，進行厭氧及好氧培養。再挑取單菌落分別接種至半固體培養基試管中，檢測固氮酶活性，再涂平板直到獲得純的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態，并確定已純化。

采用細菌16S rRNA基因通用引物27F （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進行擴增，將PCR產物直接進行序列測定，將獲得的16S rDNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發明的菌株FZJG233在分類學中的種、屬的位置。結果發現本發明的菌株FZJG233，與脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans )模式菌株NR0261081相似性為99%。16S rRNA基因序列分析，本發明的脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans.)應歸屬于脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)。

實施例2

將活化得到的單菌落采用LB液體培養基于28℃培養48小時，培養得到的培養液OD₆₀₀值為0.6時，制備濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液，以接種同樣體積的清水的為對照，每盆大麥澆灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次，15天后與未接種的對照相比，大麥的葉長、根長、鮮重、根重都達到了顯著差異，對大麥有明顯的促生作用。其中葉長增加了26.1%，根增長了21.2%，根重增加了48.2.2%，鮮重增加了100.2.%，干重增加了63.6.%（表1），促大麥生長效果見圖1。

表1 菌株FZJG233接種水稻后的促生效果

實施例3

本發明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發生。

取10μl 過夜培養的內生菌菌液滴于PDA培養基的中部，切取0.3cm×0.3cm 大小培養3-5d 的稻瘟病原菌菌塊于PDA 培養基邊緣一側，28℃培養1-2d 后，每個培養皿3 種稻瘟病菌，進行對峙培養，每個重復3 次。培養3-5d 后進行結果觀察，內生菌FZJG233對水稻稻瘟病病原菌具有拮抗作用（圖2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農林大學

<120> 一株脫氯艾德昂菌及其應用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctggcggc atgccttaca catgcaagtc gaacggtaac gcggggcaac ctggcgacga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat gcatcggaac gtgcccagta gtgggggata gcccggcgaa 120

agccggatta ataccgcata cgacctgagg gtgaaagggg gggatcgcaa gacctctcgc 180

tattggagcg gccgatgtca gattaggtag ttggtggggt aaaggcctac caagccgacg 240

atctgtagct ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

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