二肽meso?DAP?D?Ala和/或四肽L?Ala?D?Glu?L?Lys?D?Ala的新用途的制作方法

技術領域

本發明涉及化合物的新用途，具體涉及二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的新用途。

背景技術：

結核病是一種全球性的傳染性極強的疾病，全世界有1/3的人口感染結核分枝桿菌，每年由于結核病導致的死亡人數達百萬以上（Andreu N, Fletcher T, Krishnan N, Wiles S, Robertson BD.. J Antimicrob Chemother. 2012, 67: 404–414）。由于結核分枝桿菌的生長速度非常緩慢，在常用的羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養基中一般需要28天的時間才能形成肉眼可見的菌落，這給結核病的診斷、分型鑒定及藥敏試驗帶來很大的挑戰。近年來，隨著多藥耐藥結核分支桿菌(MDR-TB)及廣泛耐藥結核分支桿菌(XDR-TB)的大量出現（Espinal M A, Laszlo A, Simonsen L, et al. N Engl J Med. 2001,344:1294-1303），結核病的快速診斷和藥敏檢測顯得尤為重要，這樣可以更好的管理和治療結核病人，減少耐藥菌的傳播。盡管現代分子生物學技術在結核病研究中發揮著越來越重要的作用，但是結核分枝桿菌的培養在結核病的診斷、流行病學指標、結核菌的分型鑒定、藥敏試驗、結核病藥物的研究等方面依然有著不可替代的作用。因此，開發新的促進結核分枝桿菌快速生長的培養基對結核病的診斷、分型鑒定及藥敏試驗具有非常重要的意義。

目前，結核分枝桿菌病的培養基主要有固體培養基和液體培養基兩種。固體培養基主要有改良羅氏（Lownstein-Jenson，L-J）培養基、小川辰次（Tatsujiogawa）雞蛋培養基和美國Becton-Diskinson（BD）公司研制的Middle brook 7H10、7H11等瓊脂培養基等。液體培養基主要蘇通（Sauton）培養基和美國BD公司的Middle brook 7H9、7H12等液體培養基。其中羅氏培養基和小川辰次雞蛋培養基是以雞卵液為關鍵成分，在制備培養基時，要充分考慮雞卵液的新鮮程度以及營養成分是否受到破壞，制備培養基的過程繁多而復雜，而且結核分枝桿菌在其上的生長速度要明顯慢于BD公司的Middle brook 7H10和7H11固體培養基。以蘇通培養基和BD公司的 Middle brook系列培養基主要是由瓊脂、無機鹽類及一系列的有機化合物等成分組成（Saito H. Laboratory media for the cultivation of tubercle bacillus. Kekkaku,1998,73(5):329-337.WHO. Laboratory services in tuberculosis control,1998.）。目前，美國BD公司的Middle brook系列培養基是國外最常用于結核桿菌研究、診斷和藥敏檢測的培養基，其培養時間短，越來越受到國內外學者的關注。國內的醫院及各級疾病預防控制中心主要還是采用傳統的改良羅氏培養基來進行結核菌的分離培養、傳代培養及藥敏檢測培養。

技術實現要素：

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，通過研究結核分枝桿菌生長及復蘇機制，從結核分枝桿菌減毒株H37Ra的培養液中，通過色譜分離得到具有促進結核分枝桿菌快速生長活性的化合物二肽meso-DAP-D-Ala（內消旋二氨基庚二酸-D-丙氨酸）及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala（L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-賴氨酸- D-丙氨酸）兩種化合物。迄今為止，尚未見到有關上述兩種肽類化合物有促進結核分枝桿菌快速生長的報道，也未見到以這兩種肽類化合物中的任意一種或組合物為組分的結核分枝桿菌和卡介苗(BCG)分枝桿菌培養基上市，并依此提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala兩種肽類化合物的新用途。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制備結核分枝桿菌培養基或卡介苗分枝桿菌培養基中的應用。

本發明的第二個目的是提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制備結核菌診斷培養基、結核菌分離傳代培養基或結核病藥敏檢測培養基中的應用。

進一步的，上述的應用，所述二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的有效濃度為0.1-10μmol/mL。

本發明所述的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala是兩種白色粉末狀物質，無氣味,易溶于水，難溶于有機溶劑。其中二肽meso-DAP-D-Ala分子式為C₁₀H₁₉N₃O₅，分子量261；四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala分子式為C₁₇H₃₁N₅O₇，分子量417。這2種肽類化合物最初由結核分枝桿菌減毒株H37Ra的培養液中分離純化得到，并由上海楚肽生物科技有限公司化學合成驗證，試驗所用肽類樣品均由上海楚肽生物科技有限公司合成，兩種樣品的純度均為96.5%。

為了獲得二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的促進結核分枝桿菌的生長活性，本發明采取了以下技術路線與步驟：

1、結核分枝桿菌7H9-S液體培養基的配制：所述的7H9-S培養基組成為0.47% 7H9（購自美國BD公司，貨號271310），0.2%甘油，0.05%吐溫-80,0.085%氯化鈉，0.5%小牛血清組分Ⅴ（Roche公司，貨號10735094001），0.2%葡萄糖，0.003%過氧化氫酶（Sigma-Aldrich公司，貨號C9322-1G）。配制時先稱取0.47克7H9粉末，0.2ml甘油，0.05ml吐溫-80，加入90ml超純水后于121℃高壓滅菌10分鐘，然后加入用0.22um無菌濾膜除菌的ADC營養液10ml（ADC的配制如下：稱取0.85克氯化鈉，5克小牛血清組分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克過氧化氫酶，加入100ml超純水充分溶解，用0.22um無菌濾膜除菌后，4℃冰箱保存）。

2、二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala溶液的配制：

用電子天平分別稱取一定量的上述2種化合物放入2支試管中，分別用無菌水溶解，濃度均為50微摩爾/毫升，分別用0.22um的無菌濾膜除菌后裝入2支無菌離心管中，作為促生長試驗用的母液放入4℃冰箱保存。

3、促生長活性試驗用的培養基配制：在配制好的無菌7H9-S培養基中分別加入上述2種化合物母液，每個化合物分別配置4個濃度梯度：即10微摩爾/毫升，5微摩爾/毫升，1微摩爾/毫升，0.1微摩爾/毫升，對照組加入相等體積的無菌水。

4、對結核分枝桿菌的促生長試驗：首先從-80℃冰箱取出用甘油保存的結核分枝桿菌減毒株H37Ra,菌液濃度為1.0×10⁸CUF/ml，先4℃放置30分鐘后，取100ul菌液分別接種于裝有5ml的7H9-S對照培養基及試驗組培養基試管中，37℃培養箱中培養5天后，用酶標儀于OD600下檢測各試驗組的H37Ra菌密度，并對各試驗組于7H10（購自美國BD公司）平板上進行菌落計數。研究結果表明，上述2種化合物在0.1微摩爾/毫升—10微摩爾/毫升濃度范圍內，促生長活性非常明顯，能使結核分枝桿菌菌濃度增加5-10倍，在液體培養基中菌群密度遠遠高于空白對照組，在7H10固體培養基（7H10購自美國BD公司，貨號262710）上出現肉眼可見的菌落比空白對照組提前1周，菌斑明顯大于空白對照組。

本發明的有益效果為：本發明提供的二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala作為結核分枝桿菌的生長因子，在開發新型結核分枝桿菌快速培養基中具有很好的應用前景，可用于結核病的快速診斷、分型鑒定及藥敏檢測。

附圖說明

圖1為本發明用到的式（Ⅰ）-式（Ⅱ）的結構示意圖。

圖2為7H10固體平板培養基上促生長試驗空白對照組示意圖。

圖3為7H10固體平板培養基上促生長試驗試驗組示意圖。

具體實施方式

實施例1：

對照培養基7H9-S液體培養基的配制：

電子天平上準確稱取0.47克7H9，0.2ml甘油，0.05ml吐溫-80，加入90ml超純水后于121℃高壓滅菌10分鐘，冷卻至室溫，然后加入10ml的ADC營養液，即為配制好的7H9-S液體培養基。其中ADC營養液的配制如下：稱取0.85克氯化鈉，5克小牛血清組分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克過氧化氫酶，加入100ml超純水充分溶解后，用0.22um無菌濾膜除菌，得到配制好的ADC營養液。

實施例2：

活性試驗組培養基的配制：

用電子天平分別準確稱取一定量的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala兩種化合物放入2支試管（試驗所用樣品均購自于生工生物工程上海有限公司，2種樣品的純度均為96.5%），分別用無菌水溶解，濃度均為50微摩爾/毫升，分別用0.22um的無菌濾膜除菌后裝入2支無菌離心管中備用。然后將配制好的上述兩種化合物溶液，用配制好的7H9-S液體培養基分別稀釋至10微摩爾/毫升，5微摩爾/毫升，1微摩爾/毫升，0.1微摩爾/毫升共4個濃度梯度。

實施例3：

促生長活性測定：

從-80℃低溫冰箱中取出用甘油保存的結核分枝桿菌減毒株H37Ra, 先4℃放置30分鐘后,然后用無菌水稀釋至菌液濃度為1.0×10⁸CUF/ml，各取100ul分別接種于裝有5ml的7H9-S對照培養基及各試驗組培養基試管中，37℃培養箱中培養5天后，用酶標儀于OD600nm下讀取吸光度值，從而檢測各試驗組的H37Ra菌株的生長密度, 并對各試驗組于7H10（購自美國BD公司，貨號262710）平板上進行菌落計數（其中結核菌減毒株H37Ra由美國約翰-霍普金斯大學分子微生物學與免疫學研究所張穎教授提供給本實驗室）。結果表明，上述2種化合物在0.1微摩爾/毫升—10微摩爾/毫升濃度范圍內，促生長活性非常顯著，能使結核分枝桿菌菌濃度增加5-10倍，其中二肽meso-DAP-D-Ala組的促生長活性較強，兩種肽類化合物對結核分枝桿菌H37Ra的促生長作用見表1。

表1

同時，用7H10固體平板培養基進行促生長試驗，結果表明加入二肽和四肽后的試驗組出現肉眼可見的菌落時間為18天，空白對照組出現肉眼可見的菌落時間為23天，試驗組固體培養基出現肉眼可見的菌落比空白對照組出現肉眼可見的菌落要提前5天，且試驗組菌斑明顯大于空白對照組。固體培養基上培養18天后的結果見圖2（空白對照組）、圖3(加入二肽、四肽后的試驗組）。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。