本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉的硝酸銅配合物及合成方法和應用。
背景技術：
β-咔啉是一類廣泛分布于自然界的生物堿，它們主要存在于多種陸生植物和海洋生物中。從化學結構上分類，β-咔啉生物堿屬于吲哚類生物堿，它是由吲哚并吡啶構成的三環體系，它的骨架是一個平面分子，其中2位和9位的兩個氮原子以不同的雜化狀態存在，在9位氮原子為sp3雜化，為富π電子體系，2位氮原子為sp2雜化，為缺π電子體系。兩個氮原子與該類化合物的化學性質及生物活性密切相關。該類化合物具有廣泛的的生物學和藥理學活性，其中包括：鎮靜劑、抗焦慮、催眠、抗痙攣、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲和抗菌活性等。因此β-咔啉生物堿越來越受到研究人員的重視。
另一方面，基于藥用活性配體的藥物無機化學研究在近年來隨著生物無機化學的蓬勃發展而成為熱點研究領域，尤其以順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等為代表的第一、二、三代鉑類抗癌藥物作為一線化療藥物的成功應用，真正標志著金屬藥物研究與應用新時代的到來。但目前尚未見有以1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉為配體的硝酸銅(II)配合物及其合成方法和應用的相關報道。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種結構新穎的以1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉為配體的硝酸銅(II)配合物，以及它的合成方法和應用。
本發明涉及下式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽：
上述式(I)所示化合物的合成方法為：取如下式(II)所示化合物和硝酸銅(Cu(NO3)2·3H2O)，溶于極性溶劑中，進行配位反應，即得到目標產物；其中，所述的極性溶劑為選自甲醇和乙醇中的一種或兩種與選自水、丙酮、氯仿、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺中的一種或兩種以上的組合；
上述合成方法中涉及的原料式(II)所示化合物作為配體參與反應，其化學名稱為1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉，在本申請中也簡稱為L。該式(II)所示化合物可自行設計合成路線進行制備，優選按下述方法進行制備：
以色胺和吡啶-2-甲醛為原料，在第一有機溶劑中反應，經過脫水縮合得到化合物1；然后將化合物1置于第二有機溶劑中，加入氧化劑關環并脫氫得到化合物2(1-(2-吡啶)-β-咔啉)；再將化合物2置于堿性物質的非質子極性溶劑中，加入2-溴乙基乙醚進行取代反應，即得；其中：
所述的第一有機溶劑為選自甲苯、甲醇、乙醇、二氯甲烷和三氯甲烷中的一種或兩種以上的組合；
所述的第二有機溶劑為選自苯、甲苯、對二甲苯、冰乙酸和二氯甲烷中的一種或兩種以上的組合；
所述的氧化劑為鈀碳、醋酸錳水合物(Mn(Ac)3·nH2O)、四乙酸鉛(Pb(Ac)4)或2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌(DDQ)；
所述的堿性物質為無機堿；
所述的非質子極性溶劑為選自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和丙酮中的一種或兩種以上的組合。
上述制備式(II)所示化合物方法的合成路線如下：
試劑：(a)第一有機溶劑；(b)氧化劑，第二有機溶劑；(c)堿性物質，非質子極性溶劑。
上述式(II)所示化合物更為具體的制備方法，包括以下步驟：
①以色胺和吡啶-2-甲醛為原料，在第一有機溶劑中反應，反應過程中排出反應生成的水，待反應結束后蒸干溶劑，得到化合物1；
②將化合物1置于第二有機溶劑中，加入氧化劑，加熱條件下反應，待反應結束，過濾，收集濾液，蒸干，得到化合物2；
③取堿性物質溶于非質子極性溶劑中，然后加入化合物2和2-溴乙基乙醚進行反應，待反應結束，將反應物投入冰水中，對所得冰水混合物進行萃取，收集有機相，蒸干溶劑，即得到式(II)所示化合物(即化合物3)。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟①中，色胺和吡啶-2-甲醛的物質的量之比通常為0.8～1.2：1，反應可以在加熱或不加熱的條件下進行，反應過程中可以用分水器排出反應生成的水，反應是否完全可以可采用薄層層析(TLC)跟蹤檢測；優選地，反應采用加熱回流反應，此時反應的時間控制在2～6h較合適。該步驟中，得到的是化合物1的粗產物，為了減少后續反應中的雜質，提高后序反應的產率，優選是對所得殘渣進行純化操作后再進行后序反應。具體的純化操作可以是對所得殘渣用小極性溶劑重結晶，所得重結晶產物再用于后序反應。所述用于重結晶的小極性溶劑與現有技術相同，具體可以是石油醚和/或正己烷等。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟②中，反應優選采用加熱回流反應，反應是否完全可以可采用薄層層析跟蹤檢測。該步驟中，得到的是化合物2的粗產物，為了減少后續反應中的雜質，提高后序反應的產率，優選是對所得殘渣進行純化操作后再進行后序反應。具體的純化操作可以是對所得殘渣用選自甲醇、乙醇和二氯甲烷中的一種或兩種以上的組合溶劑進行重結晶，或者是將所得殘渣上硅膠柱層析純化，在上硅膠柱層析時，所用的洗脫劑為石油醚和二氯甲烷按6：1～1：1的體積比組成的混合溶劑。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟②中，根據氧化劑的不同，選用不同的第二有機溶劑，具體如下：
(1)當氧化劑的選擇為鈀碳時，第二有機溶劑優選為苯、甲苯和對二甲苯中的一種或兩種以上的組合，當二有機溶劑的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。所述的鈀碳可以是5％Pd/C或10％Pd/C，所述鈀碳的加入量通常按10mmol化合物1加入2～4g鈀碳計算。
(2)當氧化劑的選擇為醋酸錳水合物或四乙酸鉛時，第二有機溶劑優選為冰乙酸；所述醋酸錳水合物或四乙酸鉛的加入量通常為化合物1物質的量的2～8倍。當氧化劑的選擇為醋酸錳水合物或四乙酸鉛時，優選反應結束后用堿液調節體系的pH≥7，再對其進行萃取，收集有機相，蒸干溶劑所得的殘渣再上硅膠柱層析純化；其中，所述的堿液可以是氨水、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉、碳酸氫鈉或碳酸鉀等堿性物質的水溶液，所述堿液的濃度優選為5～30w/w％；用于萃取調pH值后體系的溶劑具體可以是乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或乙醚等。
(3)當氧化劑的選擇為2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌時，第二有機溶劑優選為苯、甲苯和二氯甲烷的一種或兩種以上的組合，當二有機溶劑的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。所述2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌的加入量通常為化合物1物質的量的1～4倍。
上述式(II)所示化合物合成方法的步驟③中，所述堿性物質、化合物2和2-溴乙基乙醚的物質的量之比通常為1～4：1：1～3，其中的堿性物質進一步可以是氫化鈉、氫化鈣、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸銫和碳酸鉀中的一種或兩種以上的組合，當堿性物質的選擇為上述兩種以上的組合時，它們之間的配比可以為任意配比。該步驟中，反應可以在0～80℃條件下進行，反應是否完全可以可采用薄層層析(TLC)跟蹤檢測；優選地，反應在20～50℃，此時反應的時間控制在1～6h較合適。對冰水混合物進行萃取的溶劑具體可以是乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、石油醚或乙醚等常規萃取溶劑。
上述式(II)所示化合物合成方法中所涉及的各種溶劑(如第一有機溶劑、第二有機溶劑以及非質子極性溶劑等)的用量，以能夠溶解各步驟中參與反應的原料為宜。
上述方法制備得到的是式(II)所示化合物的粗產物，為了進一步提高式(II)所示化合物的純度，更有利于后續反應的進行，優選是對上述所得粗產物進行純化操作后再用于本發明目標產物的合成方法中。所述的純化操作與現有技術相同，具體可以是將粗產物上硅膠柱層析純化，以得到式(II)所示化合物純品；在上硅膠柱層析時，所用的洗脫劑為二氯甲烷和甲醇按1000：1～50：1的體積比組成的混合溶劑。
本發明所述式(I)所示化合物的合成方法中，在極性溶劑的組成中，甲醇或乙醇或者是甲醇和乙醇的組合在極性溶劑中所占的比例優選為50～98v/v％；當極性溶劑中含有水、丙酮、氯仿、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺中的兩種以上的選擇時，在它們的總量不超出50％的前提條件下，它們的配比可以為任意配比。所述極性溶劑的用量可根據需要確定，通常情況下，1mmol的硝酸銅和1mmol式(II)所示化合物用5～80mL的極性溶劑來溶解。在具體的溶解步驟中，一般將硝酸銅和式(II)所示化合物混合后再加極性溶劑；也可將硝酸銅和式(II)所示化合物分別用極性溶劑溶解，再混合在一起反應。
本發明所述式(I)所示化合物的合成方法中，所述硝酸銅和式(II)所示化合物的物質的量之比可以是1～6：1。
本發明所述的式(I)所示化合物具體在合成時，可采用常壓溶液法或高壓溶劑熱法進行合成。
當采用常壓溶液法時，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和硝酸銅，溶于極性溶劑中，所得混合液于加熱或不加熱條件下反應，反應物除去部分溶劑，靜置，析出，分離出晶體，即得目標產物。
上述常壓溶液法中，反應可以在20℃至極性溶劑的回流溫度范圍內進行，優選采用回流反應，進一步優選反應是在50℃至極性溶劑的回流溫度范圍內進行，更優選是在60℃條件下反應。反應是否完全可采用薄層層析跟蹤檢測。本方法中，產物一般以晶體的形式大量生成，如果前序步驟中極性溶劑的加入量較大(如接近配比的上限)或溶劑對產物的溶解性較好，則反應后溶液可能呈澄清狀態，這是因為所形成的產物沉淀被極性溶劑溶解所致，此時可將所得反應液濃縮或減壓蒸餾以除去部分溶劑，通常是濃縮除去極性溶劑加入量的50～90％。分離得到的固體可進一步用乙醚、丙酮、乙醇、甲醇或二氯甲烷進行洗滌，之后再進行干燥。
當高壓溶劑熱法時，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和硝酸銅，溶于極性溶劑中，所得混合液置于容器中，經液氮冷凍后抽至真空，熔封，然后于30～140℃條件下反應，得到目標產物。
上述高壓溶劑熱法中，所述的容器通常為厚壁硼硅玻璃管，反應通常在30～140℃條件下進行，在此溫度條件下，反應的時間優選控制在2～24h，也可根據實際情況延長至24h以上。進一步優選混合溶液是在50～140℃條件下進行反應，更優選混合溶液是在80～100℃條件下進行反應。當反應在80℃以下的常溫或加熱條件下進行時，反應需要更長的時間才可獲得較高的產率。
本發明還包括上述式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發明還包括以上述式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽為活性成分制備的抗腫瘤藥物。
與現有技術相比，本發明提供了一種新的以1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉為配體的硝酸銅(II)配合物，以及它的合成方法和應用。申請人通過考察其對多種腫瘤細胞株的抑制作用，結果表明該配合物具有較強的體外抗腫瘤活性，且明顯高于順鉑，具有較好的潛在藥用價值，有望用于各種抗腫瘤藥物的制備。
附圖說明
圖1為本發明實施例5制得的最終產物的X射線單晶結構圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述,以更好地理解本發明的內容,但本發明并不限于以下實施例。
實施例1：式(II)所示化合物即1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉(L)的合成
1)將1.6g(10mmol)色胺、1.1g(10mmol)吡啶-2-甲醛和50ml甲苯加入150ml圓底燒瓶，加上分水器、冷凝管組成分水回流裝置，加熱回流4小時，待反應結束后蒸干溶劑，殘渣用100ml正己烷重結晶得到化合物1(2.3g,產率92％)；
2)將2.5g(10mmol)化合物1、2.5g鈀碳(10％Pd/C)和100ml對二甲苯加入250ml圓底燒瓶，加熱至回流，并用薄層層析跟蹤檢測至反應結束，靜置抽濾并將濾液蒸干，所得殘渣上硅膠柱層析純化(V石油醚：V二氯甲烷＝1:1)，得到化合物2(2.1g,產率86％)；
3)將0.24g(10mmol)氫化鈉和15ml N,N-二甲基甲酰胺加入到50ml圓底燒瓶，室溫攪拌10分鐘，再加入2.5g(10mmol)化合物2和10mmol 2-溴乙基乙醚，并用薄層層析跟蹤檢測至反應結束，然后將反應液投入500ml冰水中，用100ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，蒸干溶劑，所得殘渣上硅膠柱層析純化(V二氯甲烷：V甲醇＝100:1)，得到化合物3(2.4g,產率76％)。
對所得產物進行表征：
(1)核磁共振氫譜和碳譜，它們的波譜數據如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝4.3Hz,1H),8.54(d,J＝5.0Hz,1H),8.16(d,J＝7.7Hz,1H),8.04(d,J＝5.1Hz,1H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.91(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.63–7.54(m,2H),7.44–7.37(m,1H),7.30(ddd,J＝7.9,5.8,2.2Hz,1H),4.40(t,J＝6.4Hz,2H),3.44(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(q,J＝7.0Hz,2H),0.94(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ158.42,148.34,142.89,142.37,137.91,137.03,134.58,131.58,128.70,125.40,123.25,121.40,121.31,120.12,114.65,110.78,68.55,66.53,45.15,15.06.
(2)高分辨質譜，ESI-MS m/z:318[M+H]+.
因此，可確定上述產物即為1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉，其化學結構式如下述式(II)所示：
實施例2：配體L的合成
重復實施例1，不同的是：
步驟2)中，用Mn(Ac)3代替鈀碳，用冰乙酸代替對二甲苯，控制Mn(Ac)3的加入量為化合物1物質的量的2倍，反應在70℃條件下進行，TLC跟蹤檢測至反應結束，然后用氨水將體系的pH調至7，再用乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，蒸干溶劑，所得殘渣上硅膠柱(層析純化(V石油醚：V二氯甲烷＝1:1)，得到化合物2。
對本實施例所得產物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質譜分析，確定為目標產物1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉。
實施例3：配體L的合成
重復實施例2，不同的是：
步驟2)中，用Pb(Ac)4代替Mn(Ac)3，控制Pb(Ac)4的加入量為化合物1物質的量的5倍，反應在60℃條件下進行。
對本實施例所得產物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質譜分析，確定為目標產物1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉。
實施例4：配體L的合成
重復實施例1，不同的是：
步驟2)中，用2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌代替鈀碳，用二氯甲烷代替對二甲苯，2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌的加入量與化合物1的物質的量相等。
對本實施例所得產物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨質譜分析，確定為目標產物1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉。
實施例5：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.1mmol Cu(NO3)2·3H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml甲醇/二氯甲烷混合溶液(甲醇和二氯甲烷的體積比為3:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在50℃條件下充分反應20小時，得到綠色結晶型固體產物。
對所得產物進行表征：
(1)高分辨質譜，ESI-MS m/z:442[Cu(L)(NO3)]+.
(2)X射線單晶衍射分析，如圖1所示。
因此可確定上述產物即為以1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉為配體的銅(II)配合物即目標配合物[Cu(L)(NO3)2]，其結構式如下述式(I)所示：
實施例6：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.2mmol Cu(NO3)2·3H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml乙醇/氯仿混合溶液(乙醇和氯仿的體積比為3:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在80℃條件下充分反應12小時，得到綠色結晶型固體產物。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
實施例7：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.3mmol Cu(NO3)2·3H2O和0.1mmol配體簡稱L,再加入0.6ml甲醇/乙醇/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液(甲醇、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺的體積比為5：1：1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在100℃條件下充分反應4小時，得到綠色結晶型固體產物。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
實施例8：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
在一端開口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.4mmol Cu(NO3)2·3H2O和0.1mmol配體L,再加入0.6ml乙醇/丙酮混合溶液(乙醇和丙酮的體積比為10:1)，在抽真空的條件下，將開口端熔封，然后在80℃條件下充分反應4小時，得到綠色結晶型固體產物。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
實施例9：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
取6mmol Cu(NO3)2·3H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入80ml乙醇/水混合溶液(乙醇和水的體積比為1:1)，攪拌溶解后，加熱至60℃反應12小時，反應物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
實施例10：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
取2mmol Cu(NO3)2·3H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入50ml甲醇/丙酮/水混合溶液(甲醇、丙酮和水的體積比為30：1：10)，攪拌溶解后，加熱至50℃反應12小時，反應物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
實施例11：目標配合物[Cu(L)(NO3)2]的合成
取3mmol Cu(NO3)2·3H2O和1mmol配體L置于圓底燒瓶中，向其中加入30ml甲醇/氯仿混合溶液(甲醇和氯仿的體積比為1：1)，攪拌溶解后，于20℃反應18小時，反應物減壓濃縮除去部分溶劑，靜置，有綠色晶體析出，分離出固體，用乙醇洗滌，干燥，得到綠色晶體。
所得產物經過高分辨質譜和X射線單晶衍射分析進行結構測定，確定為目標配合物[Cu(L)(NO3)2]。
為了充分說明本發明所述配合物在制藥中的用途，申請人對其進行了體外抗腫瘤活性實驗。
實驗例1：以1-(2-吡啶)-9-(2-乙氧基乙基)-β-咔啉為配體的硝酸銅(II)配合物(按本發明實施例5所述方法制得)及配體L(按本發明實施例1所述方法制得)對多種人類腫瘤株進行體外抑制活性實驗
1、細胞株與細胞培養
本實驗選用人胃癌細胞MGC-803、人肝癌細胞株Hep G2、人膀胱癌細胞T-24、人非小細胞肺癌細胞NCI-H460以及人正常細胞HL-7702共5種細胞株。
所有腫瘤細胞株均培養在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液內，置37℃含體積濃度5％CO2孵箱中培養；人正常細胞株則培養在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養液內。
2、待測化合物的配制
將各待測化合物的DMSO儲液(濃度為0.002mol/L)通過RMPI1640培養基依次稀釋成五個濃度梯度，分別為20、10、5、2.5、1.25μmol/L，其中助溶劑DMSO終濃度≤1％。首先測試20μmol/L的各待測化合物對于腫瘤細胞增殖的抑制率，視為初篩結果；再分別測試不同梯度濃度下各待測化合物對各種腫瘤細胞的增殖抑制程度，用以擬合計算半數抑制濃度，即IC50值。
3、細胞生長抑制實驗(MTT法)
(1)取對數生長期的腫瘤細胞，經胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培養液配制成濃度為5000個/mL的細胞懸液，以每孔190μL接種于96孔培養板中，使待測細胞密度至1000～10000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底，每孔加入一定濃度梯度的藥物10μL，每個濃度梯度設4個復孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48小時，倒置顯微鏡下觀察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，繼續培養4h；
(5)終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150μL DMSO充分溶解甲瓚沉淀，振蕩器混勻后，在酶標儀用波長為570nm，參比波長為450nm測定各孔的光密度值；
(6)同時設置調零孔(培養基、MTT、DMSO)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、DMSO)。
(7)根據測得的光密度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強。
計算化合物對腫瘤細胞生長的抑制率。對于在初篩濃度下抑制率超過50％的細胞株，進一步通過SPSS軟件對五個濃度梯度的抑制率數據進行擬合，求出化合物對不同腫瘤株的半數抑制濃度(IC50值，單位μmol/L)，化合物對于不同細胞株的IC50值如表1所示。
表1：本發明所述化合物對5種細胞株的IC50值(μmol/L)
從體外抗腫瘤活性測試結果來看，本發明所述配合物具有較強的抗腫瘤活性，其活性明顯優于順鉑，有望開發成抗腫瘤藥物。