具有卵巢腫瘤靶向D構型多肽及其基因遞釋系統的制作方法

本發明涉及D構型多肽及基因遞釋系統，特別是具有與卵巢癌細胞高活性結合，具有卵巢癌靶向的D型多肽及其修飾的基因遞釋系統。

背景技術：

卵巢癌的死亡率高居婦女癌癥死亡率的前五位，并居婦科惡性腫瘤的首位。大多數卵巢癌患者在診斷時已處于晚期，而晚期卵巢癌的治療一直是一個很棘手的問題。盡管手術的改進、新藥物的上市、新化療方案的推出在一定程度上提高治療效果，但5年生存率仍未見明顯提高。化療是晚期卵巢癌治療的重要手段，但是多數晚期患者在治療后復發或耐藥，導致治療失敗。其主要原因是藥物生物分布不均，藥物無法在腫瘤組織得到有效濃度聚集，對正常的組織及器官有極大的毒副作用。因此，有必要探尋新的卵巢癌治療手段。

靶向治療使腫瘤治療進入一個新的時代。常見的靶向治療遞藥系統有納米材料載體、脂質體材料載體及病毒載體。其各有優缺點。但其中以線性聚乙烯亞胺（PEI）為載體材料包裹藥物、基因形成的納米復合物對腫瘤進行靶向治療最為常見。其有很高的藥物承載性、穩定性及轉染效率。聚乙二醇(PEG)對PEI的修飾降低了其毒性作用，同時可以連接相應的靶向配體（如：多肽、抗體等），通過受體介導內吞作用，增加靶細胞對載藥系統的特異性攝取，選擇性的遞送更多藥物進入腫瘤病灶，最終使得相同劑量藥物的療效最大化，而毒副作用最小化。

在另一方面，選擇一個有高特異性及結合能力的靶向配體亦是靶向治療的關鍵。卵巢是卵泡刺激激素（FSH）的靶器官,FSH通過卵泡刺激激素受體（FSHR）刺激卵巢中卵泡的生長。FSHR 可以在卵巢表面上皮及大部分卵巢癌組織及細胞系中找到，并且FSHR在人體中的分布比較局限，大多集中在生殖系統。目前，FSHR結合位點已經被確認，集中在FSHR重鏈的1-15, 33-53, 51 -65, 81-95氨基酸處。我們前期研究設計了與其位點對應結合的多肽片段，經過實驗驗證后表明在33-55氨基酸處的多肽與FSHR的結合力最強。其序列結構為L-FP21(YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF)。故選擇此多肽作為納米遞藥系統的靶向配體。實驗表明FSHR結合片段對納米材料的修飾能夠有效提高其對所包載的化療藥物或基因藥物的特異性遞送能力，FSHR是一種較為適宜的卵巢癌治療靶位點。

目前，越來越多的多肽配體應用在藥物靶向治療領域。但自然的多肽在人血液中并不穩定，非常容易被血清中的蛋白酶降解，這影響了多肽配體的靶向效果。

目前，尚未見到關于含有序列多肽修飾的非病毒基因遞釋系統及其在體內外轉染效率評價以及抗卵巢癌作用的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種具有卵巢腫瘤靶向D構型多肽及其基因遞釋系統，將L型多肽YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF逆序并以D構型的氨基酸替代后得到_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY) 序列多肽，作為靶向分子，利用其與FSHR的高親和性，將基因靶向輸送至卵巢癌細胞處；并且，將_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)修飾到PEI-PEG表面制得_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI（D-FP21-PP）基因載體，所述基因載體包載治療基因Gro-ɑ shRNA；可以顯著提高裸鼠皮下瘤的抑瘤率。

所述D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)多肽的N端氨基與含有琥珀酰亞胺-聚乙二醇的陽離子多聚物連接，制得非病毒基因載體材料D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-X復合物；該復合物可包載報告基因或治療基因形成非病毒基因遞釋系統；其中，該復合物中X是聚乙烯亞胺（PEI）、樹枝狀聚合物（PAMAM）、多聚陽離子氨基酸、殼聚糖或陽離子脂質體；

所述的D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-X復合物可以包載報告基因或治療基因；

所述的D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，還修飾脂質體、納米粒、聚合物膠束和高分子載體等納米給藥系統以實現腫瘤靶向。

所述_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)序列多肽，采用固相合成法制備，將_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)多肽通過雙功能分子NHS-PEG-Mal連接到PEI上，制得_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI; D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY-PEG-PEI包載pDNA。

所述基因遞釋系統分別為：D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI、D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-殼聚糖和D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-陽離子脂質體等基因遞釋系統。所述的基因遞釋系統具有卵巢腫瘤靶向特征，可以提高卵巢腫瘤體外基因轉染效率，可攜帶治療基因蓄積于卵巢腫瘤組織，用于卵巢腫瘤的治療。

所述的多肽D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，還與抗癌化療藥物聯合使用，與化療協同治療卵巢癌。

D型多肽同時保留了L型多肽的生物活性,同時可以抵抗蛋白酶的降解，在血中有較好的穩定性。

D構型多肽及基因遞釋系統，具體涉及與卵巢癌細胞表面蛋白FSHR的高結合活性、具有卵巢腫瘤靶向的D構型多肽及其修飾的基因遞釋系統 。

D構型多肽，其氨基酸序列為_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，該多肽與卵泡刺激激素受體（FSHR）有高結合活性、具有卵巢腫瘤靶向；本發明提供了由所述D構型多肽修飾的基因遞釋系統，所述D構型多肽可以介導納米遞釋系統向腫瘤靶向遞送藥物，用于實現向卵巢腫瘤的靶向治療。

本發明的優點在于，本發明構建的D構型多肽，與卵泡刺激激素受體FSHR具有高結合性、具有靶向卵巢腫瘤的能力；提供D構型多肽修飾的基因遞釋系統，可以介導納米遞釋系統向腫瘤靶向遞送藥物，用于實現卵巢腫瘤的靶向治療。經體內外實驗研究表明：D構型多肽修飾的基因載體，可以顯著提高基因轉染效率，所述基因載體包載治療基因是Gro-ɑ shRNA，可以顯著抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。

_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI/pGro-ɑ可以顯著抑制裸鼠皮下腫瘤生長。

附圖說明

圖1為D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI合成路線圖；

圖2為mPEG-PEI及D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI材料合成1H-NMR圖譜；

圖3為293T細胞及A2780細胞對L-FP21-PP及D-FP21-PP的攝取熒光照片及流式檢測結果；

圖4為D-FP21-PP/ pGro-ɑ、L-FP21-PP/ pGro-ɑ、mPP/ pGro-ɑ及PEI/ pGro-

ɑ對腫瘤細胞的轉染效率；

圖5為D-FP21-PP/ pGro-ɑ、mPP/ pGro-ɑ及PEI/ pGro-ɑ納米復合物對靶蛋白Gro-ɑ表達的沉默效果；

圖6為各治療組腫瘤生長曲線及體重變化。

具體實施方式

1）納米載體材料的合成及1H-NMR結構鑒定

定量稱取D型多肽D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)與NHS-PEG-MAL使其摩爾比為4:1。DMF充分溶解后室溫磁力攪拌進行反應6h后，加入dH2O把反應液稀釋5倍終止反應；再將該溶液置于Amicon Ultra-4（3KDa）超濾離心管中室溫3000rpm離心45min至液體約剩1ml時補充4mldH2O，如此反復10次；隨后將溶液進行凍干，獲得產物命名為D-FP21-PEG-MAL。將200mg PEI溶于100mldH2O中，充分溶解后，用1N鹽酸調節pH至7.4；取出相應體積的PEI，加入D-FP21-PEG-MAL使其質量比為0.833:1。將混合液室溫磁力攪拌24h進行反應；反應結束后，將溶液置于Amicon Ultra-4(10KDa)超濾離心管中，室溫3000rpm離心30min至液體約剩1ml時補充4ml去離子水，如此反復6次；隨后將溶液進行凍干，獲得產物分別命名為5%D-FP21-PEG-PEI。將5% D-FP21-PEG-PEI及5% PEG-PEI事先溶于氘代重水，然后上核磁共振儀讀取圖譜。結果顯示圖2所示。3.95 的雙峰和4.15 的單峰出現表明載體材料合成成功。根據氫譜中mPEG和PEI單元質子峰的峰面積，計算反應后D型多肽納米材料的接枝量分別為4.85%，與理論5%的接枝量相近。

2） 卵巢癌細胞對多肽的攝取

將卵巢癌細胞A2780及人腎上皮細胞293T細胞鋪于24孔板（每孔含2×10⁴個細胞），培養過夜。吸出培養液，加入500uL Rhodamine B、Rhodamine- L(YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF))和Rhodamine- D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)溶液，使其終濃度為5×10^-6M，37℃孵育12h，吸棄上清液，PBS潤洗，在熒光顯微境下觀察。定量分析多肽被腫瘤細胞的攝取，采用流式細胞儀測定了A2780及人正常t209細胞對Rhodamine- L(YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF))和Rhodamine- D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)的攝取熒光強度。如圖3熒光顯微鏡下觀察及流式結果可知，高表達FSHR的A2780細胞對Rhodamine- _D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)有明顯攝取，而Rhodamine- _L(YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF))的攝取低于對Rhodamine- _D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)的攝取。同時，不表達FSHR的人腎上皮細胞293T對二者均無明顯攝取。結果表明L型及D型兩種多肽均能與A2780細胞發生特異性攝取，而不與293T細胞發生作用；與L型比較，逆序D構型_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)與A2780細胞具有更好的親和性。

3）細胞毒性試驗

HO8910細胞鋪96孔板，每孔含8000個，37℃,5%CO2培養12小時后，將制備的納米DNA復合物D-FP21-PP/ pGro-ɑ、PEI/ pGro-ɑ（N/P=12）加入96孔板中，每孔20uL，含0.4μg 、0.8μg、1.6μg、2.4μg、3.2μg pGro-ɑ shRNA，每個劑量設置3個復孔。放入實時無標記細胞功能分析儀,動態觀測細胞增殖曲線，取加藥后24h時間點對藥物毒性進行分析，各組得出IC50進行比較。圖4結果表明：D-FP21-PP、PEI的IC50分別為3.04±0.26μg/ml、2.23±0.53μg/ml。D-FP21-PP比PEI材料有更低的毒性。

4） 綠色熒光蛋白質粒的轉染

將HO8910細胞以2×10⁴cells/孔接種到48孔板上,培養過夜至細胞匯合度達到70%-80%，然后加入新鮮制備的納米DNA載體復合物（N/P=12），載體材料為mPEG-PEI、D-FP21-PEG-PEI，PEG-PEI,pDNA為pGro-ɑ質粒，每孔50uL，含2ug pEGFP-N2質粒，37℃培養48h后，棄去培液，PBS洗滌2次，胰酶消化，重懸細胞于PBS中，流式細胞儀檢測轉染效率。如圖5可知，經過_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)修飾后，mPEG-PEI材料基因轉染效率從7.54%分別提高到25.79%。

5）納米復合物對Gro-ɑ蛋白表達的沉默效果

HO8910細胞以8×10³cells/孔接種到96孔板上,培養過夜至細胞匯合度達到70%-80%，棄去培養液，定量加入含10%胎牛血清的DMEM培養液0.5mL。然后加入新鮮制備的納米DNA載體復合物（N/P=12），載體材料為mPEG-PEI、D-FP21-PEG-PEI，pDNA為Gro-ɑ shRNA質粒，每孔10uL，含0.8ug質粒。37℃培養48h后。In-cell western檢測細胞Gro-ɑ蛋白表達量。細胞培養板中加入4%的多聚甲醛固定15min，0.2%Triton破膜20min后，加入1:200稀釋的兔抗人muc16單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體孵育2小時，PBST反復清洗后，按1:500稀釋加入羊抗兔 IRDye?? 800CW，驢抗鼠IRDye?? 600二抗，避光孵育1小時。用Odyssey近紅外雙色激光成像系統 700nm 和 800nm 兩個通道同時掃描微孔板，Gro-ɑ蛋白的相對值為OD₈₀₀值/OD₆₈₀值。如圖6結果表明在N/P=12時，經過FSH多肽修飾，mPEG-PEI載體的基因轉染效率顯著增強。并且，D構型多肽_D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)較mPEG-PEI轉染能力亦有增強。

6） 體內藥效學實驗

取5周齡大小裸鼠60只，皮下接種HO8910細胞6×10⁶個/200uL,隨機分為3組（N=15）：D型FSH多肽修飾的納米復合物組（L-FP21-PEG-PEI、D-FP21-PEG-PEI）；無FSH多肽修飾的納米復合物組（mPEG-PEI）；空白對照組（PBS對照）。接種后第7天開始給予納米復合藥物治療。納米材料包裹與腫瘤增殖、浸潤、轉移相關的Gro-α基因的shRNA質粒，按照5mg/Kg，200uL，3天/次，共6次，尾靜脈注射給藥。每3天測一次裸鼠體重及腫瘤體積至第6次給藥后7天。每天記錄模型裸鼠的死亡情況，繪制腫瘤生長曲線及藥物抑瘤率。體內實驗提示如圖6對照組皮下瘤體積較大，而經過D-F-PP納米基因復合物治療實驗組裸鼠皮下瘤體積均較小，與mPEG-PEI治療組比較差異具統計學意義（P<0.01）。mPP、D-F-PP抑瘤率為26.3%，58.5%。各組荷瘤裸鼠的體重無明顯減輕，表明納米材料無明顯毒副作用。