一種枯草芽孢桿菌BS01、其菌劑及其在抑制水果采后病原菌中的應用的制作方法

本發明涉及微生物學領域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01、其菌劑及其在抑制水果采后病原菌中的應用。
背景技術：
：炭疽菌(Colletotrichumspp.)是導致大多數果蔬采后病害的主要病原菌之一，其在芒果、番木瓜、鱷梨、番石榴、草霉等水果采后發生非常普遍，這些水果的采后損失大部分要歸咎于包括炭疽菌在內的采后病原真菌所致的病害腐爛。目前防治采后病原真菌主要是采用針對甾醇合成的化學殺菌劑。然而，長期高頻率地使用一類殺菌劑常引起病原菌的抗藥性，已經導致防治效果下降，甚至失效。而且，化學殺菌劑的應用存在危害人體健康及污染環境等問題，因此有必要尋找新的安全且環境友好的生物防治制劑。枯草芽孢桿菌是目前最為有效的防控植物病害的生防制劑。國外已有多個枯草芽孢桿菌生防菌株獲得商品化生產應用許可。我國利用枯草芽孢桿菌現已成功開發并投入生產的商品制劑有亞寶、百抗(B-908)、麥豐寧(B3)、紋曲寧等，其防治效果都在50％以上，主要用于農作物種植田間病害的防治。目前，用于果實采后病原真菌病害控制方面的枯草芽孢桿菌制劑并不多見。CN1853489A公開的含有枯草芽孢桿菌(CCTCCM204085)發酵液和芽孢的防腐保鮮復配制劑在果實采后防腐保鮮方面的效果較好。CN101870959A公開的枯草芽孢桿菌菌株J18的發酵劑與氯化鈣和殼聚糖混合制成干粉劑和被膜劑對多種水果的采后病害都有顯著的防治效果。CN102851244A公開了一種防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌菌株B28及其應用。CN104982516A公開的一種柑橘生物保鮮劑含有枯草芽孢桿菌R31。楊佐忠等利用枯草芽孢桿菌PRS5處理蘋果和臍橙，也取得了較好的防腐保鮮效果(參見楊佐忠等，“枯草芽孢桿菌PRS5菌劑控制水果貯藏期病害的研究”，南京林業大學學報(自然科學版)，第30卷第1期，2006年1月)。因此，枯草芽孢桿菌在采后防腐保鮮方面具有很好的應用前景。目前來看，已公布的枯草芽孢桿菌多數必須將發酵液及活菌體與化學防腐保鮮劑或其他抑菌活性物質復配才能產生良好的抑菌活性，以達到控制果實采后病害的目的。枯草芽孢桿菌活菌體的使用存在儲存時間長活性降低、對環境的適應性不穩定、定殖困難防效不穩定、使用有效劑量大、抗菌譜較窄等問題。由于枯草芽孢桿菌不同菌株的抑菌譜、抑菌作用效果等作用能力不同，差異也較大。因此分離獲得新的高效菌株一直是枯草芽孢桿菌生防制劑開發應用中需要重點解決的問題，特別是篩選可在發酵過程中高產具有高效抑菌活性發酵液的菌株，以便將發酵液上清直接用于病害的防治，避免活菌體的使用存在的各種問題。技術實現要素：鑒于現有技術中存在的問題，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01、其菌劑及其在抑制水果采后病原菌中的應用，本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清對水果采后病原菌，尤其是炭疽菌的離體抑菌活性可達90％以上，是優化前普通LB培養基發酵產生發酵液上清抑菌活性的3倍左右；以優化后發酵條件獲得的BS01菌株發酵液上清對番茄炭疽病、鱷梨炭疽病及香蕉炭疽病等炭疽病的抑制作用都能達到65％以上的防效。為達此目的，本發明采用以下技術方案：第一方面，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年8月29日，保藏編號為GDMCCNO.60069。本發明所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01，其單個細胞呈橢圓到柱狀，菌落細小圓形，表面光滑粘稠，無明顯凸起，污灰色。為進一步確定其分類學地位，擴增了BS01菌株的16SrDNA序列，經序列測定及同源性比對分析證明BS01為枯草芽孢桿菌，其16SrDNA序列(共1404bp)同已報導的多種枯草芽孢桿菌同源性達96.09％，BS0116SrDNA序列及其與基因庫中登記的枯草菌BS501(登錄號：FJ755787)、PRE23(登錄號：EU880528)、DN2.6(登錄號：EU382218)和CU03(登錄號：EF522122)的同源性比對結果如圖6-1、圖6-2和圖6-3所示。第二方面，本發明還提供了由第一方面所述的枯草芽孢桿菌BS01制備的復合微生物菌劑，具體可以是濃縮液、原液提取物、被膜劑等。其中濃縮液和原液提取物的制備方法可以是將由枯草芽孢桿菌BS01發酵得到的發酵液離心后去濕菌體得到的上清液，上清液經不同程度的蒸發、濃縮和干燥等工序得到，對于其蒸發濃縮干燥方法不作特殊限定；對于被膜劑的制備方法可以是，將由枯草芽孢桿菌BS01發酵得到的發酵液離心后去濕菌體得上清液，將上清液與果蠟、殼聚糖等成膜物質及其他果蔬保鮮功能組分復配制成的被膜劑，對于其具體的制備方法，本發明不作特殊限定。第三方面，本發明還提供了如第一方面所述的枯草芽孢桿菌BS01的發酵培養方法，所述方法包括：取活菌濃度為1×107～1×108cfu/mL的枯草芽孢桿菌BS01種子液1～4mL，接種于培養基中進行搖瓶發酵培養；所述培養基由如下組分組成：每1000mL蒸餾水中含有葡萄糖1.0％～3.0％，細菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化鈉0.5％～1.0％，pH值為7.0～8.0。其中的“％”表示質量百分含量。本發明中對枯草芽孢桿菌BS01的發酵培養基組分及含量進行了優化，其中將培養基中的碳源、氮源和無機鹽成分設置為葡萄糖1.0％～3.0％、細菌蛋白胨2.0％～3.0％和氯化鈉0.5％～1.0％的組合，這三者之間具有協同增效作用，相比采用普通LB培養基(每1000mL水中含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g)，其發酵產生的發酵液上清抑菌活性可提高3倍左右，對炭疽菌的離體抑菌活性可達到90％以上。本發明中，所述細菌蛋白胨是指市售的國產或進口peptone商品，國產的如環愷微生物產品，進口的如美國BDDifco品牌，法國Solabia品牌等等。根據本發明，所述培養基中葡萄糖的質量百分含量為1.0％～3.0％，例如1.0％、1.1％、1.3％、1.5％、1.7％、1.8％、2.0％、2.1％、2.3％、2.5％、2.8％或3.0％；所述培養基中細菌蛋白胨的質量百分含量為2.0％～3.0％，例如2.0％、2.05％、2.1％、2.15％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％；所述培養基中氯化鈉的質量百分含量為0.5％～1.0％，例如0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1.0％。根據本發明，所述培養基的pH值為7.0～8.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。根據本發明，所述培養基優選由如下組分組成：葡萄糖1.0％～3.0％，細菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化鈉0.5％～1.0％和蒸餾水1000mL，pH值為7.0～8.0。根據本發明，所述培養基進一步優選由如下組分組成：葡萄糖2.0％，細菌蛋白胨3.0％，氯化鈉1.0％和蒸餾水1000mL，pH值為8.0。本發明通過采用如上所述培養基的組分構成，其能夠使獲取的枯草芽孢桿菌BS01的發酵上清抑菌活性達到81％以上。根據本發明，所述搖瓶發酵培養的條件為：起始培養基pH值7.0～8.0，接種量10～15％，裝液量1/10～1/5，培養溫度30～37℃，培養時間48h～60h，轉速180rpm～220rpm。其中“起始培養基pH值”意指搖瓶發酵培養中所用培養基的起始pH值。根據本發明，所述搖瓶發酵培養的條件中，所述起始培養基pH值為7.0～8.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0；所述接種量為10～15％，例如10％、10.1％、10.3％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.2％、13.5％、14％、14.5％、14.8％或15％；所述裝液量為1/10～1/5，例如1/10、1/9、1/8、1/7、1/6或1/5；所述培養溫度為30～37℃，例如30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃；所述培養時間為48h～60h，例如48h、49h、50h、51h、53h、55h、56h、57h、58h、59h或60h；所述轉速為180rpm～220rpm，例如180rpm、185rpm、190rpm、195rpm、200rpm、205rpm、210rpm、215rpm或220rpm。根據本發明，所述搖瓶發酵培養的條件優選為：起始培養基pH值8.0，接種量10％，裝液量1/5，培養溫度35℃，培養時間60h，轉速220rpm。本發明通過對搖瓶發酵培養條件進行優化，能夠進一步提高獲取的枯草芽孢桿菌BS01的發酵液上清的抑菌活性，可使其高達99.34％以上。前述發酵培養方法中，種子液的培養基和培養條件與搖瓶發酵的培養基和培養條件相同或不同，本領域技術人員根據公知的培養條件進行操作。本發明所述枯草芽孢桿菌BS01的發酵培養方法，具體可以包括以下步驟：(1)保存菌種的活化：枯草芽孢桿菌BS01菌株保存于超低溫冰箱，菌種取出后在冰上解凍，然后用接種針取種在LB(每升含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g)平板上劃線培養，1天后即長出BS01單菌落；(2)種子液的制備：從上述LB固體平板上挑單菌落至50mLLB液體培養基，37℃，200rpm，培養24h后即為BS01發酵種子液；(3)發酵培養：將上述制備的種子液用無菌水調整濃度為1×107～1×108cfu/mL，按10％～15％的比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/10～1/5，然后30～37℃，180rpm～220rpm，震蕩培養48h～60h后即獲得發酵液；5000～6000rpm離心15min～20min后去除濕菌體即獲得發酵液上清。其中，優化后的發酵培養基由以下組分組成：每1000mL蒸餾水含葡萄糖1.0％～3.0％，細菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化鈉0.5％～1.0％，pH值為7.0～8.0。根據本發明，所述發酵培養基的配置方法為：將各組分按比例稱重后溶解于蒸餾水中，混合均勻后調pH值至7.0～8.0，24h內分裝進行高壓蒸汽滅菌。滅菌條件：壓力0.1MPa，溫度121℃，滅菌時間15～20min。滅菌后的培養基可暫時置于10℃下保存，應在1周內用完。第四方面，本發明還提供了由第三方面所述的發酵培養方法獲得的枯草芽孢桿菌BS01發酵液。根據本發明，所述BS01菌株發酵液上清對膠胞炭疽菌的離體抑菌活性可達90％以上，是優化前普通LB培養基發酵產生發酵液上清抑菌活性的3倍左右；以優化后的發酵條件獲得的BS01菌株發酵液上清對番茄炭疽病、鱷梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可達到65％以上的防效。本發明所述枯草芽孢桿菌BS01菌株可在發酵過程中高產具高效抑菌活性發酵液，僅使用該枯草芽孢桿菌BS01菌株的發酵液上清就可有效防治炭疽菌的離體生長及活體誘導的果實炭疽病，避免活菌體的使用存在的儲存時間長活性降低、對環境的適應性不穩定、定殖困難防效不穩定等各種問題；并且，發酵液上清制備方法簡單、產業化成本低，有利于枯草芽孢桿菌BS01菌株的產業化開發應用，避免活菌體的干燥、儲存、活化等制備步驟及其帶來的問題。第五方面，本發明還提供了如第一方面所述的枯草芽孢桿菌BS01、第二方面所述的復合微生物菌劑或第四方面所述的枯草芽孢桿菌BS01發酵液在抑制水果采后病原菌中的應用。本發明中優選將所述枯草芽孢桿菌BS01、復合微生物菌劑以及枯草芽孢桿菌BS01發酵液應用于抑制水果采后炭疽菌中，對于炭疽菌的種類，例如可以是膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)等，本發明對于果蔬中的多種炭疽病菌均能達到同樣的抑菌效果，在此不做特殊限定。雖然如此，本發明優選炭疽菌為膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)中的任意一種或其組合。本發明對水果的種類不做特殊限定，例如可以是番石榴、番木瓜、芒果、番茄、香蕉、鱷梨等，其均能達到較好的防治效果。雖然如此，本發明優選水果為番茄、香蕉或鱷梨。本發明獲得的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清對番茄炭疽病、鱷梨炭疽病及香蕉炭疽病等炭疽病的抑制作用都可達到65％以上的防效。因此，本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株是一株對果實采后炭疽菌具有很強的抑制作用的菌株。與現有技術方案相比，本發明至少具有以下有益效果：(1)本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清對膠胞炭疽菌的離體抑菌活性達90％以上，其對番茄炭疽病、鱷梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可達到65％以上的防效；(2)本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清，可避免活菌體的使用存在的儲存時間長活性降低、對環境的適應性不穩定、定殖困難防效不穩定等各種問題；(3)本發明提供的發酵液上清的制備方法簡單、產業化成本低，有利于枯草芽孢桿菌BS01菌株的產業化開發應用，避免活菌體的干燥、儲存、活化等制備步驟和帶來的問題。附圖說明圖1是采用實施例12和對比例4提供的發酵液上清抑制膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)活性的對比；圖2是采用實施例12和對比例4提供的發酵液上清抑制香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)活性的對比；圖3是采用實施例11提供的發酵上清液抑制香蕉炭疽病菌的效果圖；圖4是采用實施例11提供的發酵上清液抑制番茄炭疽病菌的效果圖；圖5是采用實施例11提供的發酵上清液抑制鱷梨炭疽病菌的效果圖；圖6-1、圖6-2和圖6-3是枯草芽孢桿菌BS01的16SrDNA序列(共1404bp)及其與基因庫中登記的枯草菌BS501(登錄號：FJ755787)、PRE23(登錄號：EU880528)、DN2.6(登錄號：EU382218)和CU03(登錄號：EF522122)的同源性比對結果。下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，并不代表或限制本發明的權利保護范圍，本發明的保護范圍以權利要求書為準。具體實施方式下面結合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下：實施例1枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01的分離與鑒定：枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01分離自廣東東莞香蕉試驗園的土壤中，根據其芽孢耐高溫的原理進行分離，方法為：取表層5-10cm的土壤100g左右，裝入紙制樣品袋中帶回實驗室分離；稱取土壤5g放入含有50mL水的三角瓶中，搖動片刻，然后慢慢加熱至沸騰，沸騰15min后靜置10min，取上層液100μL用無菌水做梯度稀釋，然后分別吸取10-2和10-3稀釋液200μL涂布到牛肉湯蛋白胨培養基上，置37℃培養2天后進行純化；從平板上挑取單菌落中的部分菌體，在同樣的培養基上進行多次劃線培養，經菌落特征觀察和鏡檢，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇多株轉接于牛肉膏蛋白胨斜面上保存。BS01為其中之一，經顯微觀察單個細胞呈橢圓到柱狀，在LB培養基上菌落細小圓形，表面光滑粘稠，無明顯凸起，污灰色。為進一步確定其分類學地位，擴增了BS01的16SrDNA序列(如圖6-1、圖6-2和圖6-3的第一行核苷酸序列所示(SEQIDNo:1))，經序列測定及同源性比對分析證明BS01為枯草芽孢桿菌，其16SrDNA序列(共1404bp)同已報導的多種枯草芽孢桿菌同源性達96.09％，BS0116SrDNA序列及其與基因庫中登記的枯草菌BS501(登錄號：FJ755787)、PRE23(登錄號：EU880528)、DN2.6(登錄號：EU382218)和CU03(登錄號：EF522122)的同源性比對結果如圖6-1、圖6-2和圖6-3所示；圖6-1至圖6-3分別是BS0116SrDNA序列的1-437bp、438-937bp、及938-1404bp同其他四種枯草菌16SrDNA序列的同源性比對結果。將枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)BS01保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年8月29日，保藏編號為GDMCCNO.60069。實施例2枯草芽孢桿菌BS01的發酵培養方法，包括以下步驟：(1)保存菌種的活化：枯草芽孢桿菌BS01菌株保存于超低溫冰箱，菌種取出后在冰上解凍，然后用接種針取種在LB(每升含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g)平板上劃線培養，1天后LB上即長出BS01單菌落；(2)種子液的制備：從上述LB固體平板上挑單菌落至50mLLB液體培養基，37℃，200rpm，培養24h后即為BS01發酵種子液；(3)發酵培養：將上述制備的種子液用無菌水調整濃度為6.5×107cfu/mL，按10％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/5，然后30℃，180rpm，震蕩培養57h后即獲得發酵液；6000rpm離心20min后去除濕菌體即獲得發酵液上清；其中，優化后的發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖2.0％，細菌蛋白胨3.0％，氯化鈉1.0％；所述發酵培養基的配置方法為：將各組分按比例稱重后溶解于蒸餾水中，混合均勻后調pH值至8.0，24h內分裝進行高壓蒸汽滅菌；滅菌條件：壓力0.1MPa，溫度121℃，滅菌時間15min。滅菌后的培養基可暫時置于10℃下保存，應在1周內用完。實施例3與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。優化后的發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖3.0％，細菌蛋白胨2.0％，氯化鈉0.5％。實施例4與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。優化后的發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖3.0％，細菌蛋白胨3.0％，氯化鈉1.0％。實施例5與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。優化后的發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖1.0％，細菌蛋白胨3.0％，氯化鈉0.5％。實施例6與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。優化后的發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖1.0％，細菌蛋白胨2.0％，氯化鈉0.5％。對比例1與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下的LB培養基外，其它與實施例2相同。LB培養基由以下組分組成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。對比例2與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。發酵培養基由以下組分組成：葡萄糖2.0％，胰蛋白胨3.0％，氯化鈉1.0％。對比例3與實施例2相比，除將優化后的發酵培養基替換為如下組成外，其它與實施例2相同。發酵培養基由以下組分組成：酵母提取物2.0％，細菌蛋白胨3.0％，氯化鈉1.0％。將上述實施例2-6和對比例1-3獲得的發酵液上清測定抑菌活性，結果如表1所示。表1通過表1可以看出，與對比例1相比，實施例2-6獲得的發酵液上清具有更高的抑菌活性，說明本發明通過對LB培養基的氮源和碳源進行優化，提高了枯草芽孢桿菌BS01發酵液上清的抑菌活性；與對比例2-3相比，實施例2-6獲得的發酵液上清同樣具有更高的抑菌活性，說明本發明通過對發酵培養基中的組分進行組合優化選擇，同樣提高了菌種發酵液上清的抑菌活性；與實施例3-6相比，實施例2所獲得的發酵液上清具有最優的抑菌活性。實施例7與實施例2相比，除發酵培養條件采用如下操作外，其它與實施例2相同。發酵培養條件：發酵培養基的起始pH值為7.0，按15％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/7，然后32℃，220rpm，震蕩培養48h后即獲得發酵液。實施例8與實施例2相比，除發酵培養條件采用如下操作外，其它與實施例2相同。發酵培養條件：發酵培養基的起始pH值為7.0，按10％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/10，然后30℃，220rpm，震蕩培養55h后即獲得發酵液。實施例9與實施例2相比，除發酵培養條件采用如下操作外，其它與實施例2相同。發酵培養條件：發酵培養基的起始pH值為8.0，按10％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/10，然后30℃，220rpm，震蕩培養55h后即獲得發酵液。實施例10與實施例2相比，除發酵培養條件采用如下操作外，其它與實施例2相同。發酵培養條件：發酵培養基的起始pH值為7.0，按15％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/7，然后37℃，220rpm，震蕩培養60h后即獲得發酵液。實施例11與實施例2相比，除發酵培養條件采用如下操作外，其它與實施例2相同。發酵培養條件：發酵培養基的起始pH值為8.0，按10％比例轉接至優化后的發酵培養基中；搖瓶的裝液量為瓶容積的1/5，然后35℃，220rpm，震蕩培養60h后即獲得發酵液。將上述實施例7-11獲得的發酵液上清測定抑菌活性，結果如表2所示。表2實施例7實施例8實施例9實施例10實施例11平均抑菌率(％)86.2285.6584.6582.8299.34通過表2可以看出，與實施例7-10相比，實施例11所獲得的發酵液上清具有更有的抑菌活性，說明本發明通過對發酵培養條件進行優化，可進一步提高發酵液上清的抑菌活性。實施例12與實施例2相比，采用的發酵培養基組成為：葡萄糖2％，細菌蛋白胨3％，氯化鈉0.5％，pH值為7；發酵條件為：接種的種子液濃度為1×107cfu/mL，按10％比例轉接至優化后的培養基中，裝液量為搖瓶的1/5，溫度32℃，200rpm，震蕩培養60h后的發酵液上清。對比例4與實施例2相比，采用LB為發酵培養基，其組成為胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，按5％接種1×108cfu/mL的種子液，裝液量為搖瓶的1/5，37℃，200rpm震蕩培養48h的發酵液上清。對照例在M3S培養基上正常生長的膠胞炭疽病菌。將上述實施例12和對比例4獲得的發酵液上清分別測定對膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)及香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)的抑菌活性，計算方法為(對照例菌圈平均直徑-對比例4/實施例12菌圈平均直徑)/對照例菌圈平均直徑。結果如表3所示，其中實施例12和對比例4以及對照例獲得的發酵液上清的抑菌圈如圖1和圖2所示。圖1-2中的“對照”是采用對照例的發酵上清液獲得的結果；“優化前”是指采用對比例4的發酵上清液獲得的結果；“優化后”是指采用實施例12的發酵上清液獲得的結果。表3由表3、圖1和圖2均可以看出，在對發酵培養基和培養條件進行優化后，相比采用對比例4的LB培養基和培養條件，實施例12獲得的發酵液上清具有更高的抑菌活性，幾乎完全抑制了兩種所測炭疽菌的離體生長。對膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)來說，是優化前普通LB培養基發酵產生發酵液上清抑菌活性的3倍左右，對香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)的抑制率也提高了20％以上。實施例13實施例11獲得的發酵液上清抑制香蕉、番茄、鱷梨炭疽病菌的效果表4和圖3、圖4、圖5為香蕉、番茄、鱷梨經挑選及表面消毒后創傷接種炭疽病菌孢子液，放置過夜后用實施例11所采用的優化培養基及優化發酵條件獲得的發酵液上清浸泡處理2～3min，然后貯藏在室溫條件下觀察統計果實炭疽病的發病情況。發病率＝發病的果實個數/處理的總果實個數，相對防治效果(％)＝(未處理對照病情指數-處理病情指數)/未處理對照病情指數X100。各處理病情指數＝100X∑(各級別病果數X各級別代表值)/(調查總果數X最高級代表值)。其中化學殺菌劑是采用珠海真綠色技術有限公司的保鮮劑產品，為咪酰胺和抑霉唑的混合懸濁液。表4通過表4和圖3、圖4、圖5都可以看出，采用實施例11所獲得的優化發酵液上清處理接種有炭疽菌的香蕉、番茄和鱷梨，均可顯著抑制炭疽病病斑的擴展，相對防治效果在65％以上，并可顯著降低果實炭疽病菌的發病率。綜合上述結果可以看出，本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清對膠胞炭疽菌的離體抑菌活性可高達90％以上，其對番茄炭疽病、鱷梨炭疽病及香蕉炭疽病的抑制作用都可達到65％以上的防效；而且，本發明所提供的枯草芽孢桿菌BS01菌株發酵液上清，可避免活菌體的使用存在的儲存時間長活性降低、對環境的適應性不穩定、定殖困難防效不穩定等各種問題。由于菌種發酵液上清的制備方法簡單、產業化成本低，有利于枯草芽孢桿菌BS01菌株的產業化開發應用，避免活菌體的干燥、儲存、活化等制備步驟和帶來的問題。申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特征，但本發明并不局限于上述詳細結構特征，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特征才能實施。所屬
技術領域：
的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁1 2 3