本發(fā)明涉及一種PCR模板的制備方法，具體涉及一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，尤其是應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織。
背景技術(shù)：
：：煙草(Nicotianatabacum)目前是國(guó)內(nèi)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。培育優(yōu)質(zhì)、低害、抗病抗逆、適產(chǎn)的煙草品種是目前煙草育種的主要目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為煙草育種的重要方法。近年來(lái)，隨著Crispr-Cas9技術(shù)的發(fā)展，在煙草基因組中定點(diǎn)突變一個(gè)或多個(gè)基因甚至是整個(gè)基因家族成為可能。該技術(shù)能夠?qū)δ繕?biāo)性狀進(jìn)行精確改良，通過(guò)篩選得到穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，不僅能夠縮短作物的育種周期，還能夠解決傳統(tǒng)育種方法不易解決的問(wèn)題，如有害性狀與優(yōu)良性狀的緊密連鎖不易打破分離。這給煙草的轉(zhuǎn)基因育種帶來(lái)了新的機(jī)遇。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，生物技術(shù)的研究領(lǐng)域逐漸拓展到生物科學(xué)的各個(gè)方面，核酸水平的研究是分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容，PCR技術(shù)作為研究核酸的主要工具，在分子生物學(xué)領(lǐng)域扮演著越來(lái)越重要的角色。在植物研究領(lǐng)域諸如突變體的鑒定，轉(zhuǎn)基因植株的鑒定，基因擴(kuò)增等均需要利用到PCR技術(shù)，PCR擴(kuò)增技術(shù)需要DNA作為模板。針對(duì)于煙草等作物的檢驗(yàn)，為了降低假陽(yáng)性的存在，在抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)基因苗還需進(jìn)行進(jìn)一步的檢驗(yàn)。目前，多采用簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高的PCR方法進(jìn)行這一檢測(cè)。而要進(jìn)行PCR檢測(cè)則首先需對(duì)被檢測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取。目前，在眾多植物種類(lèi)中應(yīng)用最廣泛的提取DNA的方法是采用商業(yè)化的試劑盒或是基于CTAB/SDS裂解后的酚即氯仿抽提法或者是由此為基礎(chǔ)衍生而來(lái)的改良法。然而，這些方法都需要在液氮或是冷凍干燥條件下將樣品粉碎，緊接而來(lái)的是很多繁瑣的步驟進(jìn)行DNA的純化。這些方法不僅用到很多有害試劑和昂貴的試劑儀器，并且用到的植物組織多，步驟繁瑣費(fèi)時(shí)，因此當(dāng)需要檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株較多時(shí)，這些方法顯得不太適用。在植物領(lǐng)域也有一些快速提取DNA的方法報(bào)道。然而，所有這些建立在堿液裂解基礎(chǔ)上的快速提取方法模板在進(jìn)行PCR之前都需要進(jìn)行加熱/煮沸或者加入中和液(TE或者Tris-HCl)進(jìn)行中和。這一些額外的步驟顯然會(huì)增加樣品之間的交叉污染，樣品多時(shí)也會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡(jiǎn)便、成本低，沒(méi)有交叉污染，能夠在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品。本發(fā)明所述的一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，其特征在于：以NaOH溶液為提取液，將提取液與植物葉片組織放入到離心管中，直接在磨樣機(jī)上磨樣，得到的上清液直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中優(yōu)選方案如下：所述的NaOH溶液的摩爾濃度為0.01mol/L～0.1mol/L，更優(yōu)選為0.01mol/L。所述的磨樣機(jī)的工作轉(zhuǎn)速頻率為20～25Hz，磨樣時(shí)間為1.5～3min，更優(yōu)選為工作轉(zhuǎn)速頻率23Hz，磨樣時(shí)間2min。綜上所述，本發(fā)明可以按照以下步驟進(jìn)行：將直徑0.25mm的鋼珠和250μL摩爾濃度為0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的離心管中，再取8～12mm2植物葉片組織放入，然后在磨樣機(jī)上以23Hz頻率磨樣2分鐘，取1μL上清液即可直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明制備方法得到的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序：PCR擴(kuò)增體系采用20μL反應(yīng)體系，包括2×PCRMix10μL，前引物和后引物各6pmol，DNA模板1μL，用ddH2O補(bǔ)齊體積。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃條件下預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。取6μLPCR產(chǎn)物在150V電壓，1.5％瓊脂糖凝膠中電泳15min檢測(cè)擴(kuò)增情況。凝膠用EB進(jìn)行染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)建立了一種快速高效的制備轉(zhuǎn)基因煙草樣品DNA的方法，此方法采用0.01mol/L的NaOH溶液為提取液，破碎轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織后無(wú)需經(jīng)過(guò)加熱煮沸中和等步驟，上清液可直接用作PCR反應(yīng)的模板；(2)用此方法制備的DNA模板PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，與傳統(tǒng)SDS提取法和試劑盒提取法獲得的DNA相比，PCR結(jié)果沒(méi)有明顯差異；(3)該方法還可以應(yīng)用于小麥、高粱、水稻、玉米等作物上，同樣取得了很好的實(shí)驗(yàn)效果；(4)該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡(jiǎn)便、成本低，沒(méi)有交叉污染，能夠在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品，因此能夠?qū)Υ罅康霓D(zhuǎn)基因煙草樣品進(jìn)行DNA的快速提取和鑒定。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1中采用不同濃度NaOH溶液制備DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：1mol/LNaOH溶液；2：0.5mol/LNaOH溶液；3：0.25mol/LNaOH溶液；4：0.1mol/LNaOH溶液；5：0.05mol/LNaOH溶液；6：0.01mol/LNaOH溶液；7：0.001mol/LNaOH溶液)；圖2為實(shí)施例3中采用不同品牌PCRMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：全式金AS111PCRMix；2：ThermoScientificK1081PCRMix；3：擎科梓熙TSE004PCRMix；4：MDBioP002PCRMix；A：引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S擴(kuò)增結(jié)果；B：引物Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR擴(kuò)增結(jié)果)；圖3為實(shí)施例4中采用不同DNA提取方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳分析比較圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR擴(kuò)增結(jié)果；2：Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR擴(kuò)增結(jié)果；3：Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR擴(kuò)增結(jié)果；4：Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR擴(kuò)增結(jié)果；A：SDS方法提取DNA模板；B：實(shí)施例2方法提取DNA模板)；圖4為實(shí)施例5中通過(guò)Crispr-Cas9技術(shù)編輯的煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1-2：非轉(zhuǎn)基因K326對(duì)照；3-6：Crispr-Cas9載體陽(yáng)性但gDNA未編輯植株；7-8：Crispr-Cas9載體陽(yáng)性且gDNA編輯植株，A：Crispr-Cas9技術(shù)編輯Ntab0067020基因植株；B：Crispr-Cas9技術(shù)編輯Ntab0104030基因植株)；圖5為實(shí)施例5中A1，A3，A7，A8植株的測(cè)序結(jié)果(圖中黑色陰影顯示的為Crispr-Cas9技術(shù)編輯的基因靶點(diǎn)序列)；圖6為實(shí)施例5中B1，B3，B7，B8植株的測(cè)序結(jié)果(圖中黑色陰影顯示的為Crispr-Cas9技術(shù)編輯的基因靶點(diǎn)序列)；圖7為實(shí)施例6中不同作物應(yīng)用不同DNA提取方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳分析比較圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：小麥；2：高粱；3：煙草；4：棉花；5：水稻；6：玉米，A：試劑盒法提取DNA；B：實(shí)施例2所述的方法提取DNA)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例中所用到的引物說(shuō)明：實(shí)施例1：針對(duì)NaOH提取液適宜濃度篩選試驗(yàn)：如圖1所示，0.01mol/L到0.1mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明NaOH溶液粗提物可以直接作為PCR反應(yīng)的模板。0.001mol/L的NaOH溶液提取的模板雖然也能擴(kuò)增出條帶，但條帶亮度較弱，而高于0.25mol/L(包含0.25mol/L)的NaOH溶液制備的DNA模板則不能擴(kuò)增出條帶。從擴(kuò)增效果和節(jié)約試劑的角度最終選擇0.01mol/L的NaOH溶液作為提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2：一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，將直徑0.25mm的鋼珠和250μL摩爾濃度為0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的離心管中，再取10mm2左右的植物葉片組織放入，然后在磨樣機(jī)上以23Hz頻率磨樣2分鐘，取1μL上清液即可直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)此方法，應(yīng)用于實(shí)施例3～6中。實(shí)施例3：采用不同品牌PCRMix擴(kuò)增結(jié)果：如圖2所示，常用的4種不同品牌PCRMix對(duì)0.01MNaOH濃度制備的模板用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進(jìn)行擴(kuò)增，4種PCRMix均能擴(kuò)增出明亮單一的條帶，擴(kuò)增結(jié)果之間沒(méi)有明顯的差異。實(shí)施例4：不同DNA提取方法擴(kuò)增結(jié)果比較：對(duì)用傳統(tǒng)SDS方法提取的DNA作為模板和實(shí)施例2所述方法提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行比較。如圖3所示，4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因特異引物Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR，Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR，Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在SDS法和實(shí)施例2所述方法提取的DNA模板上進(jìn)行擴(kuò)增均能擴(kuò)增出條帶清晰，明亮的條帶。兩種方法制備的模板PCR擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有顯著差異。實(shí)施例5：在鑒定煙草轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用：對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)確認(rèn)的兩個(gè)通過(guò)Crispr-Cas9技術(shù)編輯的煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽(yáng)性植株在編輯位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了兩個(gè)基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用實(shí)施例2所述的方法獲得模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序驗(yàn)證。如圖4所示，引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株上均能擴(kuò)增出明亮單一的條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖5、圖6所示，以A1，A3，A7，A8和B1，B3，B7，B8植株的測(cè)序結(jié)果為例：A3和B3植株為已知轉(zhuǎn)入Crispr-Cas9載體但未能在基因組上成功編輯的植株，基因特異引物擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果分別與對(duì)照A1和B1一致；而A7，A8和B7，B8是在基因組上成功編輯的植株，可以看到在這4株植株上擴(kuò)增的片段在各自的靶位點(diǎn)上都進(jìn)行了編輯，存在堿基的插入/缺失，與之前的鑒定結(jié)果一致。說(shuō)明本方法提取的DNA模板可以用來(lái)對(duì)通過(guò)Crispr-Cas技術(shù)編輯的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性苗的鑒定。實(shí)施例6：在其他作物上的應(yīng)用：如圖7所示，對(duì)小麥、高粱、煙草、棉花、水稻及玉米等作物的幼葉用試劑盒及實(shí)施例2所述方法制備的模板進(jìn)行ACTIN基因的擴(kuò)增。結(jié)果表明，通過(guò)試劑盒方法制備的模板能在5種作物上擴(kuò)出條帶，而通過(guò)實(shí)施例2所述方法制備的模板在棉花中的擴(kuò)增失敗，但在其他4種作物上均能夠擴(kuò)增出條帶，且與試劑盒擴(kuò)增的效果基本一致，在煙草和水稻中甚至能擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)1.5kb的片段。綜和上述所有實(shí)施例所述，本方法可以適用于大量轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性株的鑒定工作，節(jié)約時(shí)間成本。建立的DNA提取方法簡(jiǎn)單快速，粗提上清液可以直接用來(lái)作為PCR反應(yīng)的模板，能夠有效的對(duì)煙草轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。利用此方法進(jìn)行DNA模板制備，一個(gè)工作人員在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)就可以提取至少600個(gè)樣品，提高了工作效率。此方法與之前建立的很多一步法堿裂解DNA提取方法相比，最大的改進(jìn)是上清液不經(jīng)加熱或中和就可以直接用來(lái)作為模板，這樣盡最大的可能節(jié)省了時(shí)間、降低了費(fèi)用并且還能有效的避免不同樣品之間的交叉污染。另外，此方法只利用大約10mm2的植物材料就可以提取足夠200次PCR反應(yīng)的模板溶液，大大減少了對(duì)植物材料的浪費(fèi)。因此，篩選可以在植株生長(zhǎng)的早期進(jìn)行，加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。雖然傳統(tǒng)的SDS提取法和試劑盒提取的DNA量多質(zhì)優(yōu)，但是PCR技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求并不高，只需要一點(diǎn)模板的存在就可以成功擴(kuò)增。本方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了此方法提取的DNA在煙草及其他作物如小麥、高粱、玉米中能夠穩(wěn)定的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、穩(wěn)定，在煙草和水稻中甚至能擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)1.5kb長(zhǎng)的片段。因此，此方法可以在這些作物中得到廣泛的應(yīng)用。但是用此方法制備的模板卻不能在棉花中成功擴(kuò)增。文獻(xiàn)(XinZ，VeltenJP，OliverMJ，etal.High-throughputDNAextractionmethodsuitableforPCR[J].Biotechniques，2003，34(4)：820-827.)在快速法(有堿提取液煮沸中和的步驟)提取擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中也得到了類(lèi)似的結(jié)果，煙草和高粱組織制備模板后在PCR混合體系中加與不加雜質(zhì)抑制劑BSA和PVP都能擴(kuò)增出條帶，但是棉花組織卻必須加入BSA和PVP才能夠成功擴(kuò)增。文獻(xiàn)(BurrK，HarperR，LinacreA.One-stepisolationofplantDNAsuitableforPCRamplification[J].Plantmolecularbiologyreporter，2001，19(4)：367-371.)報(bào)道超過(guò)1mm2的植物材料進(jìn)行粗提時(shí)，其中的葉綠素等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)，或許棉花葉片組織中的一些物質(zhì)能夠抑制TaqDNA聚合酶的活性，從而影響擴(kuò)增效果。本方法采用的NaOH法制備PCR擴(kuò)增模板不需要液氮、不需要昂貴的儀器、無(wú)需離心、無(wú)需更換離心管、沒(méi)有加熱煮沸中和等步驟，粗提物可直接用作PCR反應(yīng)的模板。進(jìn)行大量樣品DNA模板制備時(shí)能夠在最大程度上節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)花費(fèi)并減少樣品之間的交叉污染。此方法用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，重復(fù)性好。此外，此方法的所有步驟都在室溫操作并且10mm2左右的葉子制備的DNA模板就足夠200余次PCR反應(yīng)使用，可減少對(duì)樣品的浪費(fèi)并在植株生長(zhǎng)早期即可進(jìn)行檢測(cè)，加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。當(dāng)前第1頁(yè)1 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