本發明涉及發酵技術領域，涉及一種發酵液及其制備方法和應用，更具體涉及一種類芽孢桿菌CGMCC No.8333發酵液及其制備方法以及其促進植物乳桿菌ST-III在牛乳基質中生長的作用。
背景技術：
植物乳桿菌ST-III對人體具有巨大的益生作用，自中國發明專利ZL03116377.7首次公開了植物乳桿菌ST-III菌株及其調節血脂方面的應用后，近年來對植物乳桿菌ST-III的研究也越來越多，在中國發明專利ZL200410066891.7中又公開了其能夠降低血清膽固醇和提高高密度脂蛋白膽固醇含量，具有控制或減輕體重，輔助減肥的功效，也有報道其具有粘附腸道上皮細胞的作用，可見植物乳桿菌ST-III對人體有多方面的益處，同時植物乳桿菌ST-III全基因組于2010年測定，并在實際生產中得到廣泛應用。
然而，經過研究發現，將植物乳桿菌ST-III添加到牛乳中培養，生物量很低，幾乎沒有生長，分析其原因可能是無法利用牛乳自主合成某些必須營養物質。目前主要的促生長手段是通過外源添加一些必須氨基酸或多肽類等促生長物質，由于這些原料價格昂貴，增加了企業成本，限制了植物乳桿菌ST-III的部分應用。因此尋找一種來源安全，制備簡單，價格低廉的促進植物乳桿菌ST-III生長物質十分必要。
技術實現要素：
針對現狀，為解決現有技術中的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種發酵液，該發酵液通過對類芽孢桿菌CGMCC No.8333進行發酵培養得到，該發酵液具有促進植物乳桿菌ST-III在乳生長的作用。
本發明的目的之二是提供一種上述發酵液的制備方法，通過合適的發酵條件對其進行培養，得到的發酵上清液菌種活性高。
本發明的目的之三是提供一種上述發酵液的應用，即該發酵液具有促進植物乳桿菌ST-III在乳中生長的作用。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
一種類芽孢桿菌發酵液，所述發酵液是由類芽孢桿菌CGMCC No.8333經過發酵培養而得的發酵上清液。
一種制備上述類芽孢桿菌發酵液的方法，所述方法包括如下步驟：
(1)活化：將類芽孢桿菌CGMCC No.8333接種于TYC培養基中，在溫度為25-35℃、搖床轉速為150-200rpm/min的條件下培養24h作為種子液；
(2)擴培：按照體積百分比為3％的接種量將種子液接種于質量百分比為10％的脫脂乳培養基中，在25-35℃、150-200rpm/min的條件下培養96-168h得純培養物；
(4)離心：將步驟(2)所得純培養物于溫度為4-15℃、轉速為5000-10000rpm/min條件下離心5-10min，取上清液即得類芽孢桿菌發酵液。
上述制備類芽孢桿菌發酵液的方法中，步驟(2)所述的培養時間優選為120-144小時，更優選為120小時。
上述制備類芽孢桿菌發酵液的方法中，步驟(3)所述的溫度為優選為5-10℃，更優選為10℃；和/或轉速優選為6000-9000rpm/min，更優選為8000rpm/min。
所述的TYC培養基為常規的TYC培養基，由以下組分組成：胰蛋白酶胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸鈉20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，瓊脂18g/L，余量為水。
所述的脫脂乳培養基也是常規的脫脂乳培養基，是將脫脂乳粉(購自恒天然商貿(上海)有限公司的)溶解于水中混合即得，需要說明的是，這里所述百分比為所述脫脂乳粉占所述脫脂乳粉和所述水總質量的質量百分比。
上述類芽孢桿菌發酵液也可以制成凍干粉，即將離心得到的上清液(類芽孢桿菌發酵液)進行真空冷凍干燥3天，即得所述的凍干粉。
本發明的一個重要的發明點在于所述的類芽孢桿菌發酵液在乳制品中的應用。經過試驗證明所述類芽孢桿菌發酵液具有促進植物乳桿菌ST-III在乳中生長的作用。
在上述應用中，申請人通過以下具體操作步驟進行：
(1)將類芽孢桿菌發酵液于115-121℃條件下，滅菌處理15-20min；
(2)然后將滅菌處理后的類芽孢桿菌發酵液按照體積百分比為10-30％的比例加入到質量百分比為10％的乳液中，混合均勻，得混合乳液；
(3)將活化好的植物乳桿菌ST-III以體積百分比為2％的比例接種至混合乳液中，混合均勻，35℃下靜置培養16-24小時。
其中，優選地，所述類芽孢桿菌發酵液的添加量為20％，所述百分比為體積百分比。
并且本發明所采用的乳液為本領域常規乳原料，較佳的為選自生牛乳、脫脂牛乳和復原乳中的任意一種，更佳的為選自生牛乳和脫脂乳中的任一種。
本發明所采用的類芽孢桿菌，保藏編號為CGMCC No.8333,保藏時間為2013年10月14日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，該菌株的分類命名是類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，培養物名稱為BD3526，并且該類芽孢桿菌CGMCC No.8333已經在中國發明專利ZL201310752153.7中首次公開，該專利的申請日是2013年12月31日，公開日是2014年4月23日。
需要說明的是，如果沒有特殊說明，本發明所采用的各種試劑和原料均能夠通過市場購買而得。
本發明的有益效果為：
(1)本發明提供的發酵液制備方法簡單，設備要求低，成本低廉；采用的類芽孢桿菌CGMCC No.8333來源于食品，安全無毒，發酵制備的上清液可直接應用于食品加工中。
(2)本發明最重要的發明點在于本發明制備的發酵液對植物乳桿菌ST-III在乳中的生長具有顯著促進作用，極大的提高了植物乳桿菌ST-III在實際產品開發中的應用潛力。
具體實施方式
下面將對本發明進行更詳細地描述，應該注意的是，可以以各種形式實現本發明而不應被這里闡述的實施例所限制。相反，提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發明，并且能夠將本發明的范圍完整的傳達給本領域的技術人員。
如在通篇說明書及權利要求當中所提及的“包含”或“包括”為一開放式用語，故應解釋成“包含但不限定于”。說明書后續描述為實施本發明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發明的范圍。本發明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。
實施例1
類芽孢桿菌CGMCC No.8333發酵液的制備方法，具體如下：
(1)活化：將類芽孢桿菌CGMCC No.8333接種于50ml TYC培養基中，在溫度為25℃、搖床轉速為200rpm/min的條件下培養24h作為種子液；
(2)擴培：按照體積百分比為3％(V/V)的接種量將種子液接種于500ml質量百分比為10％的脫脂乳培養基中，在溫度為25℃、搖床轉速為200rpm/min的條件下培養120h得純培養物；
(3)離心：將步驟(2)所得純培養物于溫度為10℃、轉速為8000rpm/min條件下離心10min，取上清液即得類芽孢桿菌發酵液。
實施例2
類芽孢桿菌CGMCC No.8333發酵液的制備方法，具體如下：
(1)活化：將類芽孢桿菌CGMCC No.8333接種于50mlTYC培養基中，在溫度為30℃、搖床轉速為180rpm/min的條件下培養24h作為種子液；
(2)擴培：按照體積百分比為3％的接種量將種子液接種于500ml質量百分比為10％的脫脂乳培養基中，在溫度為30℃、搖床轉速為180rpm/min的條件下培養144h得純培養物；
(3)離心：將步驟(2)所得純培養物于溫度為10℃、轉速為10000rpm/min條件下離心5min，取上清液即得類芽孢桿菌發酵液。
實施例3
類芽孢桿菌發酵液的制備方法，包括如下步驟：
(1)活化：將類芽孢桿菌CGMCC No.8333接種于TYC培養基中，在溫度為35℃、搖床轉速為150rpm/min的條件下培養24h作為種子液；
(2)擴培：按照體積百分比為3％的接種量將種子液接種于質量百分比為10％的脫脂乳培養基中，在35℃、150rpm/min的條件下培養96h得純培養物；
(5)離心：將步驟(2)所得純培養物于溫度為15℃、轉速為6000rpm/min條件下離心8min，取上清液即得類芽孢桿菌發酵液。
實施例4
類芽孢桿菌CGMCC No.8333發酵液凍干粉的制備方法，具體如下：
(1)活化：將類芽孢桿菌CGMCC No.8333接種于50mlTYC培養基中，在溫度為30℃、搖床轉速為180rpm/min的條件下培養24h作為種子液；
(2)擴培：按照體積百分比為3％的接種量將種子液接種于500ml質量百分比為10％的脫脂乳培養基中，在溫度為30℃、搖床轉速為180rpm/min的條件下培養168h得純培養物；
(3)離心：將步驟(2)所得純培養物于溫度為4℃、轉速為10000rpm/min條件下離心5min，取上清液即得類芽孢桿菌發酵液。
(4)將離心得到的上清液進行真空冷凍干燥3天，即得所述的凍干粉。
為了證明類芽孢桿菌CGMCC No.8333發酵液對植物乳桿菌ST-III在乳中的促生長作用，申請人進行了如下實驗，具體包括如下實驗例和對比例：
實驗例1
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：在無菌操作條件下將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基(即乳酸細菌培養基，由以下組分組成：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、檸檬酸氫二銨2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫801.0mL/L、乙酸鈉5.0g/L、K2HPO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·H2O 0.25g/L、瓊脂18.0g/L、蒸餾水1L、pH：6.2～6.6)，35℃靜置培養18h備用；
(2)取8ml生牛乳在121℃條件下滅菌處理15min，冷卻至室溫備用；
(3)取上述實施例1制備的上清液(類芽孢桿菌發酵液)2ml滅菌處理后添加到步驟(2)得到的生牛乳中；
(4)將步驟(1)制備的植物乳桿菌ST-III種子液以2％(v/v)比例接種至步驟(3)所得的生牛乳中，35℃條件下靜置培養24h，結果是牛乳出現凝乳現象。
實驗例2
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：在無菌操作條件下將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基，35℃靜置培養18h備用；
(2)取5mL 10％脫脂乳118℃，滅菌處理20min，冷卻至室溫備用；
(3)取實施例2制備的上清液(類芽孢桿菌發酵液)1ml滅菌處理后添加到步驟(2)滅菌處理后的脫脂乳中；
(4)將步驟(1)制備的植物乳桿菌ST-III種子液以2％(v/v)比例接種步驟(3)所得的脫脂乳中，35℃靜置培養24h，結果是牛乳出現凝乳現象。
實驗例3
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：在無菌操作條件下將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基，35℃靜置培養18h備用；
(2)取6ml生牛乳在118℃條件下滅菌處理20min，冷卻至室溫備用；
(3)取實施例1制備的發酵上清液4ml滅菌處理后添加到步驟(2)生牛乳中；
(4)將步驟(1)制備的種子液以2％(v/v)比例接種步驟(3)所述的生牛乳中，在35℃條件下靜置培養24h，結果是牛乳pH下降，發生凝乳。
實驗例4
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：無菌操作將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基種，35℃靜置培養18h備用；
(2)取5ml生牛乳在118℃條件下滅菌處理15min，冷卻至室溫備用；
(3)取實施例4制備的發酵上清液凍干粉0.1g，去離子水復溶至10ml，取1ml滅菌處理后添加到步驟(2)滅菌處理后的牛乳中；
(4)將步驟(1)制備的植物乳桿菌種子液以2％(v/v)比例接種至步驟(3)所得的牛乳中，在35℃條件下靜置培養24h，結果是牛乳出現凝乳現象。
實驗例5
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：無菌操作將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基種，35℃靜置培養18h備用；
(2)取5ml生牛乳在118℃條件下滅菌處理15min，冷卻至室溫備用；
(3)取實施例4制備的發酵上清液凍干粉0.1g，去離子水復溶至10ml，取1ml滅菌處理后添加到步驟(2)滅菌處理后的牛乳中；
(4)將步驟(1)制備的植物乳桿菌種子液以2％(v/v)比例接種至步驟(3)所得的牛乳中，在35℃條件下靜置培養16h，結果是牛乳出現凝乳現象，pH從6.44降到5.04，活菌數達到8.92Log CFU/ml。
對比例1
(1)植物乳桿菌ST-III種子液的制備：無菌操作條件下將植物乳桿菌ST-III純培養物以2％(v/v)比例接種至MRS培養基，35℃靜置培養18h備用；
(2)取8ml生牛乳在118℃條件下滅菌處理15min，冷卻至室溫備用；
(3)將步驟(1)制備的種子液以2％(v/v)比例接種步驟(2)所述的生牛乳中，在35℃條件下靜置培養24h，牛乳未出現凝乳現象。
在培養時間均為24h的情況下，將上述實驗例1～4和對比例1進行pH值及凝乳情況進行對比，結果見表1，具體是采用pH計測定乳培養液pH值；觀察培養過程中培養基凝乳情況；利用MRS平板傾注法對乳培養基中的ST-III菌落計數，單位為log CFU/ml。
表1 pH值及凝乳情況對比
由表1可知，對比例1在沒有加入類芽孢桿菌發酵液的情況下，經過24h后pH值下降不明顯(僅從6.44下降到6.04)，沒有發生凝乳現象，并且菌落數也相對來講增加的較少，實驗例1～4和對比例1相比，在經過24h培養后pH值分別從6.04降低至5.01、4.83、4.70、4.74，牛乳發生凝乳現象，并且活菌數從8.00log CFU/ml分別提高至9.26log CFU/ml、9.27CFU/ml、9.27CFU/ml、9.28CFU/ml，從對比數據來看，本發明的類芽孢桿菌發酵液極大提高了植物乳桿菌ST-III的生物量，能夠顯著促進植物乳桿菌ST-III在牛乳基質中的生長。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明實質內容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。