嗜鹽芽孢桿菌及其應用的制作方法

本發明屬于環境微生物領域，具體涉及一種嗜鹽芽孢桿菌及其應用。

背景技術：

隨著經濟與社會發展，人類活動產生的污染物，使一些天然鹽環境遭受不同程度的污染，或者使環境受到污染物與高鹽的雙重污染。例如，由于事故、泄露和排放等，每年數億加侖石油及其工業廢水(鹽度＞3.5％W/V)污染江口、海灘和煉油廠附近等鹽度較高的地區。城市生活污水、生產殺蟲劑和除草劑的制藥廠等釋放的工業廢水，也含較高濃度的鹽和有毒的污染物。利用微生物降解環境中的污染物具有成本低、效率高、以及不易造成二次污染等優點，一直受到廣泛關注。但是，高鹽條件下微生物既要忍受長期的高滲透壓脅迫，又要承受短期的滲透沖擊。當鹽度＞3％時，非嗜鹽微生物的代謝會受到抑制，使其生物修復效率明顯降低，甚至喪失修復。

嗜鹽微生物屬于極端微生物范疇，能夠在高鹽環境中棲息繁殖。因此，利用嗜鹽微生物修復污染的天然鹽環境或處理排放的高鹽度有機污染物廢水，不需要通過稀釋、反滲透、離子交換、或者電滲透等方法降低待處理樣品的鹽度，具有操作簡單和成本低廉等諸多優點。如KUbo構建了由葡萄球菌及臘質芽孢桿菌組成的COD微生物處理系統，在15％條件下能削減COD 70-90％。Kulichevskaya等從石油鹽礦中分離得到1株屬于鹽桿菌屬(Halobacterium)的極端嗜鹽古菌，在30％NaCl條件下，該菌仍然能夠降解C10～C30直鏈烷烴。因此，開發嗜鹽微生物種質資源對于高鹽廢水及環境修復等方面具有重要的理論研究價值和廣闊的應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在于彌補現有嗜鹽微生物資源的不足，而提供一株新的嗜鹽芽孢桿菌。本發明的另一個目的在于提供一種利用嗜鹽芽孢桿菌制備的微生物制劑及其在高鹽廢水凈化方面的應用。

本發明所采取的技術方案是：

一、本發明嗜鹽芽孢桿菌(Bacillus lacus ZQ1)，簡稱B.lacus ZQ1，系從山西省運城市的鹽湖底泥中分離篩選的芽胞桿菌，其菌株2016年7月8日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC No.60055。

本發明的發明內容如下：

本發明菌株從山西省運城市的鹽湖底泥中進行分離、純化所得，其分離純化方法如下：

(1)取5.0g山西省運城市的鹽湖底泥接種于pH值為7.2的冨集集分離培養基中，30℃、200rpm/min震蕩培養；當培養3d后，以10％的接種量將培養液轉接至另一新鮮的冨集分離培養基，30℃、200rpm/min震蕩培養。如此富集培養四代。

(2)將第四代反應后的培養液采用稀釋平板法稀釋到10^-5-10^-6，將稀釋后的培養液0.1mL均勻涂布于瓊脂固體培養基上，置于30℃培養48h，挑取單菌落進行分離與純化。

所述冨集集分離培養基組成是：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl為200g/L，pH值為7.2。所述固體分離培養基組成是：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl為200g/L，瓊脂粉20g/L，pH值為7.2。

該菌株具有下述性質：

B.lacus ZQ1菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌體大小為1.5-2.0μm×0.6-0.9μm，極生鞭毛，具運動性。在瓊脂固體培養基平板上好氧培養3d后，菌落圓形，乳白色，中央突起，不透明，菌落直徑為2-3mm。在鹽濃度范圍為0-25％條件下能生長與增殖。

二、本發明還提供了一種嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑，嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑是用上述述的嗜鹽芽孢桿菌(B.lacus ZQ1)通過發酵制備的。

三、本發明還提供了一種嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的制備方法：上述嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的發酵步驟如下：

(1)搖瓶培養：從B.lacus ZQ1斜面上挑取菌苔一環接入裝有100-500mL的LB液體培養基的錐形瓶中，30-37℃、150-240rpm/min搖床震蕩發酵培養12-36h；所述的LB液體培養基配方為：酵母浸膏5g；胰蛋白胨10g；NaCl 200g；水1000mL；pH 7.2；

(2)種子罐發酵：將步驟(1)培養好的B.lacus ZQ1發酵液按2％-5％的接種量接入10L發酵培養基的發酵罐中，30-37℃、150-200rpm/min發酵培養12-36h；所用發酵培養基配方為上述LB液體培養基；

(3)發酵罐發酵：將步驟(2)培養好的B.lacus ZQ1發酵液按2％-10％接種量接入10L發酵培養基的發酵罐中，30-37℃、150-200rpm/min發酵培養24-72h；所用發酵培養基配方為上述LB液體培養基；

(4)菌劑制備：將步驟(3)發酵液加入固體輔料中，固體輔料與發酵液的質量比為1-3∶1-5，攪拌均勻，20-37℃烘干，粉碎，經40目過篩，包裝裝袋；所述固體輔料為活性碳30-60％、硅藻土40-70％；制得嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑，總菌數達到5億/克以上。

四、嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑在高鹽廢水凈化方面的應用：

在高鹽廢水中按2-15％比例接種嗜鹽芽孢桿菌微生物制，經序批式活性污泥法處理后， 測定出水中COD及總氮含量。以常規污水處理工藝、不添加嗜鹽微生物制劑作為對照。取樣測定COD、總氮濃度。

本發明提供了一種嗜鹽芽孢桿菌及其微生物制劑，可以廣泛地應用于高鹽廢水的水質凈化。本發明與現有技術相比具有如下優點與積極效果：可以在25％以下的高鹽濃度中生長與增殖。使用本嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑，不需要通過稀釋、反滲透、離子交換、或者電滲透等方法降低高鹽廢水的鹽度，可以直接應用于高鹽廢水凈化，具有操作簡單和成本低廉等優點。

附圖說明

圖1本發明B.lacus ZQ1在20000倍下的掃描電鏡照片。

圖2本發明B.lacusZQ1的系統發育樹。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

嗜鹽芽孢桿菌(B.lacus ZQ1)的培養、分離、篩選、鑒定及保存：

1.1菌株的培養、分離

本發明的芽孢桿菌B.lacus ZQ1是通過對山西運城鹽湖底泥富集培養進行分離純化得到的。

具體分離純化方法包括以下步驟：

(1)取5.0g山西運城鹽湖底泥接種于pH值為7.2的冨集集分離培養基中，30℃、200rpm/min震蕩培養；當培養3d后，以10％的接種量將培養液轉接至另一新鮮的冨集分離培養基，30℃、200rpm/min震蕩培養。如此富集培養四代。

(2)將第四代反應后的培養液采用稀釋平板法稀釋到10^-5-10^-6，將稀釋后的培養液0.1mL均勻涂布于瓊脂固體培養基上，置于30℃培養48h，挑取單菌落進行分離與純化。所述冨集集分離培養基組成是：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl為200g/L，pH值為7.2。所述固體分離培養基組成是：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl為200g/L，瓊脂粉20g/L，pH值為7.2。

1.2菌體形態特性

采用常規的細菌電子顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌體大小為1.5-2.0μm×0.6-0.9μm，極生鞭毛，具運動性。

1.3菌落形態特性

在瓊脂固體培養基平板上好氧培養3d后，菌落圓形，乳白色，中央突起，不透明，菌 落直徑為2-3mm。

1.4生理生化特征

對菌株B.lacus ZQ1進行生理生化特征的鑒定，其結果見表1。

表1.菌株生理生化鑒定結果

(表中：+表示為陽性，W表示為弱陽性，-表示為陰性)

由鑒定結果(表1)可知：菌株B.lacus ZQ1好氧，能在0-25％NaCl的培養液中生長，而最適NaCl為1％；生長溫度為25-45℃，最適生長溫度為37℃；pH值為6.5-9.5，最適pH為7.5；接觸酶陽性，氧化酶陰性；具有七葉甙水解活性、明膠水解活性。菌株B.lacus ZQ1能夠利用鼠李糖、己二酸、L-海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露醇作為碳源；G+C含量為52.1％。

1.5分子生物學特征

采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24∶1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提 取細菌總DNA。采用16S rRNA通用引物F27和R1492擴增細菌的16S rRNA，將PCR擴增產物回收后進行測序。再將得到的堿基序列在GenBank等國際核酸序列數據庫內進行同源序列搜索(Blast search)，找出該菌株與數據庫中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等國際菌種保藏中心的菌株。B.lacus ZQ1的系統發育樹見圖2。

根據比對結果發現，該菌株與芽孢桿菌B.Qingdaonensis DSM 16318的16S rRNA序列具最高同源性，相似度為97.1％；分子雜交結果顯示，該菌株與芽孢桿菌B.Qingdaonensis DSM16318DNA-DNA相關性為45.12％。

綜上所述，16S rRNA同源序列比對可以確定本發明菌株B.lacus ZQ1屬于芽孢桿菌屬。但是由于本發明菌株B.lacus ZQ1具有許多與現有芽孢桿菌顯著不同的表型特征，加上DNA-DNA雜交和分子生物學分析結果表明本發明菌株不屬于芽孢桿菌屬的已有任何種。因此，根據現有數據，可以判定本發明菌株為芽孢桿菌屬的一個新種。分類學名稱：芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。本發明將其稱為Bacillus lacus ZQ1，簡寫為B.lacus ZQ1，于2016年7月8日在廣東省微生物菌種保藏中心保藏(地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓)，編號為：GDMCC No.60055。

實施例2

嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑，嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑是用實施例1所述的嗜鹽芽孢桿菌(B.lacus ZQ1)通過發酵制備的。

實施例3

嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的制備方法一：實施例2所述的嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的發酵步驟如下：

(1)搖瓶培養：從B.lacus ZQ1斜面上挑取菌苔一環接入裝有LB液體培養基的錐形瓶中，37℃、200rpm/min搖床震蕩培養24h。所述的LB液體培養基配方為：酵母浸膏5g；胰蛋白胨10g；NaCl 200g；水1000mL；pH 7.2。

(2)種子罐發酵：將上述培養好的B.lacus ZQ1發酵液接入10L發酵罐中，37℃、200rpm/min發酵培養36h；所用發酵培養基配方為上述液體培養基。

(3)發酵罐發酵：將上述培養好的B.lacus ZQ1發酵液接入100L發酵罐中，37℃、200rpm/min發酵培養48h；所用發酵培養基配方為上述液體培養基。

(4)菌劑制備：將上述發酵液加入固體輔料中，固體輔料與發酵液的質量比為1.5∶1，攪拌均勻，28℃烘干，粉碎，經40目過篩，包裝裝袋。固體輔料含有活性碳60％，硅藻土40％。制得的脫氮微生物菌劑成品經活菌計數，總菌數達到5億/克以上。

嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的制備方法二：實施例2所述的嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑的發酵步驟如下：

具體方法為：

(1)搖瓶培養：從B.lacus ZQ1斜面上挑取菌苔一環接入裝有LB液體培養基的錐形瓶中，30℃、200rpm/min搖床震蕩培養24h。所述的LB液體培養基配方為：酵母浸膏5g；胰蛋白胨10g；NaCl 150g；水1000mL；pH 7.2。

(2)種子罐發酵：將上述培養好的B.lacusZQ1發酵液接入10L發酵罐中，30℃、200rpm/min發酵培養24h；所用發酵培養基配方為上述液體培養基。

(3)發酵罐發酵：將上述培養好的B.lacus ZQ1發酵液接入100L發酵罐中，30℃、200rpm/min發酵培養48h；所用發酵培養基配方為上述液體培養基。

(4)菌劑制備：將上述發酵液加入固體輔料中，固體輔料與發酵液的質量比為2∶1，攪拌均勻，28℃烘干，粉碎，經40目過篩，包裝裝袋。固體輔料含有活性碳40％，硅藻土60％。制得的脫氮微生物菌劑成品經活菌計數，總菌數達到5億/克以上。

實施例4

嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑在高鹽廢水凈化方面的應用：

在城市生活污水工藝中，按2％比例投入實施例2所述的嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑，經序批式活性污泥法處理后，測定出水中COD含量。以常規污水處理工藝、不添加嗜鹽微生物制劑作為對照。結果表明，在處理后，添加嗜鹽微生物制劑后，7.5％鹽濃度的城市生活污水COD平均去除率為87.5％，總氮去除率為89.8％，而對照COD去除率為78％，總氮去除率為82.4％，說明嗜鹽微生物制劑能夠促進高鹽廢水中COD及總氮去除。

實施例5

嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑在城市污水處理中的應用：

選用經活性污泥厭氧與爆氣處理后的城市生活污水，其鹽濃度調節為15％，處理前COD為156mg/L，氨氮為55mg/L，總氮85mg/L。試驗使用二級沉降池的有效容積為50L，溫度25℃，投入實施例2所述的嗜鹽芽孢桿菌微生物制劑3.0g，連續運行6h，測定COD、氨氮、總氮濃度。以不添加微生物制劑的處理作為對照。結果見表明，添加實施例4的微生物菌劑后，COD平均去除率為21.5％，氨氮去除率為70.8％，總氮去除率為60％，而對照處理COD平均去除率僅為6.8％，氨氮去除率為12.5％，總氮去除率為15.2％。結果表明嗜鹽微生物制劑能夠加快高鹽濃度廢水的凈化。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。