調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其應用的制作方法

本發明公開了調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因，屬于基因工程領域。

背景技術：

乙醛脫氫酶(ALDH)是一類依賴于NAD(P)+的酶類，負責催化生物體內各種醛類至對應羧酸。根據蛋白序列差異，植物中至今發現有13個ALDH家族(Sophos and Vasiliou 2003)，除丙二醛等共通底物外，各家族ALDH有不同的專化底物，參與多條生化途徑。多數ALDH由于有不同程度的解細胞醛毒功能，被認為參與植物鹽、旱等脅迫響應(Brocker et al.2013)，其中，ALDH10,12,18三類，由于參與甜菜堿與脯氨酸的代謝，作為耐逆相關ALDH被研究得較多。

ALDH10在植物中被認為參與氨基醛類的氧化，如氨基丁醛，所以又被稱為氨基醛脫氫酶(AMADH)(Sebela et al.2000)。此外，ALDH10又被稱為BADH，負責把甜菜醛(betaine aldehyde，BA)氧化成甜菜堿(glycinebetaine，GB)，參與植物的耐逆途徑，如菠菜(Incharoensakdi et al.2000)，紅樹(Hibino et al.2001)和擬南芥(Missihoun 2011)，雖然大多數作物中的ALDH10對甜菜醛的催化活性不如氨基醛。一些異源轉基因實驗也能從側面驗證ALDH10對提高植物耐逆能力有幫助(Zhou et al.2008)。

技術實現要素：

技術問題

本發明的目的在于提供一種調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其應用。

技術方案

本發明提供一種調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因，所述基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因編碼的蛋白質，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本發明所述AhALDH10基因的應用。具體指其通過植物表達載體轉入目的植物內，能提高植物的耐旱性。所述植物優選是模式植物大豆。

有益效果

本發明公開了花生AhALDH10及其所編碼的蛋白質，該基因在花生中為首次報道。熒光定量表達分析表明該基因受鹽和旱誘導；轉大豆功能驗證顯示，該基因能提高甜菜堿合成量1倍左右，從而提高植株對旱脅迫的抗性。

本發明提供的AhALDH10基因是首次在花生中分離的新基因，為花生中首次報道，AhALDH10與模式作物中的ALDH10基因有80％以上的蛋白序列同源，轉大豆實驗表明，其功能與植物耐旱相關，可作為目的基因導入植物，提高植物耐旱性，以進行植物品種改良。

附圖說明

圖1：PCR擴增后的凝膠電泳結果

注：圖中第一道：DL2000marker；第二、三道：AhALDH10

圖2：花生與模式作物ALDH10蛋白同源比較。

注：序列從上至下：擬南芥ALDH10a8，ALDH10a9，水稻ALDH10a5，ALDH10a8，花生AhALDH10

圖3：qPCR分析AhALDH10基因在干旱和鹽脅迫(4h、8h、12h)下在花生根、葉片中的表達情況

圖4：轉基因大豆土培法耐旱性鑒定結果

注：上：AhALDH10轉基因大豆，下：對照；A處理前，B干旱處理2周，C復水1周

圖5：對照和轉基因大豆旱處理后葉片甜菜堿含量

具體實施方式

實施例1：AhALDH10基因的獲得

選用花生品種：抗旱花生品種豐花1號，光照培養箱中萌發生長，待生長至3葉期幼苗，取部分葉片在液氮下快速研磨成粉狀，利用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.^TMPlant RNAKit，購自OMEGA公司)提取樣品的總RNA，并用DNAse Ⅰ進行消化處理。利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，NanoDrop-2000型分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。再通過反轉錄試劑盒將總RNA反轉合成cDNA。

根據花生轉錄組測序結果，挑選了具有完整ORF的、注釋為ALDH10基因家族的cDNA序列，根據其預測序列的5′和3′端的非編碼區分別設計了特異性引物P1、P2(表1)，以上述的cDNA為模板，以94℃預變性5min；94℃變性30s，58-60℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環；72℃延伸10min為反應條件進行PCR擴增。擴增片段經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，回收后連接到質粒載體pGEM-T，然后轉化大腸桿菌菌株JM109感受態細胞，經選擇性LB培養基(IPTG、X-gal、Amp)得到陽性克隆，菌液培養后測序分析。測得序列與預測序列一致，命名為AhMYB31，AhMYB31的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；結構域和系統進化樹分析表明與擬南芥、水稻已知的ALDH10基因有80％以上的蛋白同源(見圖2)，命名為AhALDH10。

表1：說明書中涉及的引物相關信息

實施例2：AhALDH10基因的表達分析

選用花生品種：抗旱花生品種豐花1號，光照培養箱中萌發生長，待生長至3葉期幼苗，分別進行干旱(20％PEG6000)及高鹽(1％NaCl)處理，分別取0h、4h、8h、12h的葉片樣品，液氮冷凍后，-80℃冰箱保存。再利用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TM Plant RNAKit，購自OMEGA公司)分別提取樣品的總RNA，并反轉成cDNA。

基于AhALDH10序列設計定量引物P3、P4(表1)，以花生TUA5基因引物為內參對照，根據Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(TaKaRa)操作說明配制反應體系，每個反應3次重復；反應程序為：94℃變性5min；94℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸40s，40個循環；于ABI PRISM 7000實時定量PCR儀上檢測表達量。采用2^-ΔΔCT算法(Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method.Methods,2001,25:402-408)分析試驗結果，其中ΔΔCT＝(CT_樣本-CT_TUA5)Time x-(CT_樣本-CT_TUA5)Time 0，其中CT_樣本和CT_TUA5分別是AhALDH10和內參基因TUA5的CT值；Time x和Time 0分別為處理的不同時間點(脅迫處理4、8、12h)和對照(脅迫處理0h)。

結果如圖3所示，AhALDH10在根中表達較高，干旱處理4h該基因表達量增加了10倍，鹽脅迫4h后該基因表達量提高了5倍，可以看出該基因對于干旱脅迫更為敏感。此外，干旱處理4h后，花生葉片甜菜堿含量從12.4μmol·g-1上升至37.1μmol·g-1，說明甜菜堿途徑參與到花生耐逆響應中。

實施例3：轉化大豆及轉基因功能驗證

植物表達載體采用載體pTF101(帶35S啟動子和Bar篩選標記)(Takara公司)，利用重組試劑盒進行載體構建。將獲得的重組表達載體質粒轉入農桿菌EHA105感受態，經選擇性LB培養基(50mg/L Rif、100mg/L Kan)得到陽性克隆，菌液培養后通過農桿菌介導法轉入大豆。收獲的T₀代種子分別經除草劑及基因引物進行陽性鑒定。獲得的陽性株系繼續種植，單株收獲。

土培法耐旱性鑒定：將T₂代轉基因種子及野生型種子進行春化處理3-4天，再用次氯酸鈉進行消毒后，播種至營養缽中，正常長至4葉期，用20％PEG6000進行模擬干旱處理(陳娜等，2014，核農學報，花生中脅迫相關基因AhDHN1的克隆及非生物脅迫下表達分析)，對照進行正常澆水。2周后置換營養土，正常復水處理。

如圖4，對照大豆干旱2周以后，已經基本萎蔫，復水處理后仍不能正生長，但轉基因大豆干旱2周以后，葉片只是略有缺水癥狀，復水以后很快很恢復正常。同時我們對各樣品大豆葉片中的甜菜堿含量也進行了測量，見圖5，我們發現轉基因大豆中甜菜堿含量在干旱過程中維持在一個較高的水平，比對照將近高出一倍，

綜上所述本發明人提供的AhALDH10基因是首次在花生中分離的新基因，為花生中首次報道。AhALDH10與模式作物中的ALDH10基因有80％以上的蛋白序列同源，轉大豆實驗表明，其功能與植物耐旱相關，該基因能提高甜菜堿合成量1倍左右，從而提高植株對旱脅迫的抗性。AhALDH10可作為目的基因導入植物，提高植物耐旱性，以進行植物品種改良。

本發明涉及的序列及記號分列如下：

SEQ ID NO.1(1512bp)

ATGGAAATCCCAATCCCAACTCGACAGTTGTTCATTGACGGAGAATGGAAGCCCCCCATCCTCAGTAACAGAATTCCAATTATCAACCCTTCCACTCAGCAAGTCGTCGGGGACATTCCAGCTGCCACCAAGGAGGATGTAGACGCCGCCGTCGCCGCCGCTAGAAGAGCACTCAACCGCAACAAAGGCAACGACTGGCCTTCTGCTTCCGGCGCTCACCGAGCCCGCTATCTCCGCGCCATCGCTGCCAAGGTCGTCGAGAGAAAGGATCACCTCGCTAAGCTTGAATCCCTTGATTGCGGAAAACCACTCGATGAAGCTGCCTGGGACATGGATGATGTTGCTGGTTGCTTCGAGTTCTACGCTGACCTTGCCGAGAAACTCGACGCTAAGCAGAAGGCAACCGTTTCTCTTCCCATGGAAACTTTCAAGAGTTATGTCCTCAAAGAACCCATTGGTGTTGTTGGATTAATCACCCCATGGAACTATCCTCTGTTAATGGCTACATGGAAGGTTGCCCCTGCTCTGGCAGCTGGTTGTGCTGCGATATTGAAGCCTTCTGAATTGGCATCTGTGACATGTTTGGAGCTGGCTGACATATGCAAAGAAGTGGGCCTTCCTCCGGGTGTATTAAATATTCTCACTGGATTAGGCCCTGATGCTGGTGCTCCCTTAGCTTCCCACCCTGACGTAGACAAGATTGCCTTTACTGGAAGCTCTGCAACTGGAAGCAAGGTTATGACAGCTGCTGCACAATTAGTCAAGCCTGTCTCACTAGAGCTTGGTGGAAAAAGCCCAATCATTGTTTTTGAGGATGTTGATCTTGATAAGGCTGCTGAATGGACCCTCTTTGGTTGCTTCTGGACAAATGGTCAGATATGCAGTGCAACTTCCCGCCTTATTGTTCATGAAAGTATAGCAGCAAAATTTTTGGATACCCTTGTCAAATGGGCCAAAAACATCAAAGTTTCAGATCCCTTTGAAGAAGGTTGCAGGCTAGGCCCTGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAAAAAATATTGAAGTTTATCTCAAATGCTAAGAGTGAGGGCGCAACCATTTTGACTGGTGGATCTCGTCCAGAGCATCTAAAGAATGGATTTTTTATTGAACCAACCATTATAACGGATGTGACTACCTCCATGCAAATTTGGAAAGAAGAAGTATTTGGACCCGTGCTCTGTGTAAAAACATTTAGTACTGAGGAAGAGGCTCTCGATCTAGCACATGACACCATCTATGGGTTAGGAGCTGCTGTCATTTCAAATGACCTTGAAAGATGTGATCGTGTATCTAAGGCGTTTAAGGCTGGAATTGTATGGATCAATTGCTCTCAACCATGTTTTACTCAAGCCCCATGGGGAGGCACGAAACGTAGTGGTTTTGGTCGCGAATTAGGAGAATGGGGACTTGACAACTACTTGAGCGTGAAGCAAGTTACTCAGTATATCTCTAATGATCCATGGGGCTGGTACCAGTCTCCTTCAAAGCTGTGA

SEQ ID NO.2(503aa)

MEIPIPTRQLFIDGEWKPPILSNRIPIINPSTQQVVGDIPAATKEDVDAAVAAARRALNRNKGNDWPSASGAHRARYLRAIAAKVVERKDHLAKLESLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEFYADLAEKLDAKQKATVSLPMETFKSYVLKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCAAILKPSELASVTCLELADICKEVGLPPGVLNILTGLGPDAGAPLASHPDVDKIAFTGSSATGSKVMTAAAQLVKPVSLELGGKSPIIVFEDVDLDKAAEWTLFGCFWTNGQICSATSRLIVHESIAAKFLDTLVKWAKNIKVSDPFEEGCRLGPVVSEGQYEKILKFISNAKSEGATILTGGSRPEHLKNGFFIEPTIITDVTTSMQIWKEEVFGPVLCVKTFSTEEEALDLAHDTIYGLGAAVISNDLERCDRVSKAFKAGIVWINCSQPCFTQAPWGGTKRSGFGRELGEWGLDNYLSVKQVTQYISNDPWGWYQSPSKL

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省農業科學院

<120> 調控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其應用

<130> 0

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> 豐花1號

<220>

<221> 花生AhALDH10基因

<222> (1)..(400)

<223>

<400> 1

atggaaatcc caatcccaac tcgacagttg ttcattgacg gagaatggaa gccccccatc 60

ctcagtaaca gaattccaat tatcaaccct tccactcagc aagtcgtcgg ggacattcca 120

gctgccacca aggaggatgt agacgccgcc gtcgccgccg ctagaagagc actcaaccgc 180

aacaaaggca acgactggcc ttctgcttcc ggcgctcacc gagcccgcta tctccgcgcc 240

atcgctgcca aggtcgtcga gagaaaggat cacctcgcta agcttgaatc ccttgattgc 300

ggaaaaccac tcgatgaagc tgcctgggac atggatgatg ttgctggttg cttcgagttc 360

tacgctgacc ttgccgagaa actcgacgct aagcagaagg 400

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> 豐花1號

<220>

<221> 花生AhALDH10基因編碼的蛋白質

<222> (1)..(400)

<223>

<400> 2

Met Glu Ile Pro Ile Pro Thr Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1 5 10 15

Lys Pro Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr

20 25 30

Gln Gln Val Val Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Lys Glu Asp Val Asp

35 40 45

Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu Asn Arg Asn Lys Gly Asn

50 55 60

Asp Trp Pro Ser Ala Ser Gly Ala His Arg Ala Arg Tyr Leu Arg Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ala Lys Val Val Glu Arg Lys Asp His Leu Ala Lys Leu Glu

85 90 95

Ser Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp

100 105 110

Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Ala Glu Lys Leu

115 120 125

Asp Ala Lys Gln Lys Ala Thr Val Ser Leu Pro Met Glu Thr Phe Lys

130 135 140

Ser Tyr Val Leu Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro

145 150 155 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

180 185 190

Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Val Leu Asn Ile Leu Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly Ala Pro

210 215 220

Leu Ala Ser His Pro Asp Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Lys Val Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Val Lys Pro

245 250 255

Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Ile Val Phe Glu Asp

260 265 270

Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp

275 280 285

Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Val His Glu

290 295 300

Ser Ile Ala Ala Lys Phe Leu Asp Thr Leu Val Lys Trp Ala Lys Asn

305 310 315 320

Ile Lys Val Ser Asp Pro Phe Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val

325 330 335

Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Leu Lys Phe Ile Ser Asn Ala

340 345 350

Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Ser Arg Pro Glu His

355 360 365

Leu Lys Asn Gly Phe Phe Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Thr

370 375 380

Thr Ser Met Gln Ile Trp Lys Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys

385 390 395 400

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P1

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 3

atggaaatcc caatcccaac tc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P2

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 4

tcacagcttt gaaggagact ggtac 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P3

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 5

ttgcttcgag ttctacgctg ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P4

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 6

acaccaatgg gttctttgag ga 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213>

<220>

<221> TUA5-F

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 7

ctgatgtcgc tgtgctcttg g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>

<220>

<221> TUA5-R

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 8

ctgttgaggt tggtgtaggt agg 23