本發明涉及了一種菌培養方法及其應用，尤其是涉及了一種益生菌的高密度培養方法及其應用。
背景技術：
益生菌，英文probiotics一詞由希臘語“for live”派生而來，譯為“為了生命”，是含有生理活性的活菌，當被機體經過口服或其他給藥方式攝入適當的數量后，能夠定植于宿主并改善宿主微生態平衡，從而發揮有益作用。近年來的研究表明，人體內的細菌多達1000多種，特別是胃腸道內的細菌最為豐富，占全身微生態菌總數80％左右，是人體細胞的10倍，被譽為人類的“第二基因組”。這些細菌有助于人體消化食物，產生維生素以預防食物中細菌所誘發的疾病，同時刺激免疫系統。隨著研究的深入，發現腸道微生物在許多慢性疾病和癥狀中，如炎癥、肥胖、糖尿病、還有癌癥等也起了關鍵作用。微生物的數量和基因數量驚人，強烈影響人類的健康。這些發現為益生菌產品在食品、保健品、醫藥、養殖、環境、衛生用品等領域的應用帶來了巨大的推動力。目前，益生菌被廣泛用于酸奶、乳酸菌飲料、益生菌粉劑、動物飼料、環境治理等產品中，形成了相對完整和成熟的益生菌行業。
值得注意的是，益生菌只有達到一定的數量水平時，益生菌才能在宿主體內產生相應的效果。所以，以益生菌為功能成分的食品、保健品或藥品需要保證所含活的益生菌數量保持在一定的水平。這一需求對益生菌的生產和制備提出了相應的要求。在益生菌的培養過程中，實現高密度培養，不但可以滿足后續益生菌產品的功能需求，還可以提高益生菌生產環節中的生產效率，減少培養體積，縮短生產周期，降低生產成本。因此，益生菌的高密度培養是當前益生菌開發和生產中的關鍵技術問題。
液體發酵體系中，中國發明專利(公開號：CN 101230323A)在培養過程中添加堿性鹽和脫氧劑以消除嗜酸乳桿菌或兩歧雙歧桿菌發酵時所受到的脅迫物質酸或氧，使最終產品中活菌數量提高2-4倍。中國發明專利(公開號：CN 101418270A)在干酪乳桿菌Zhang的培養過程中，通過加入NaOH、KOH或氨水等中和劑和通氮氣的方法，得到1011CFU/mL以上活菌數的干酪乳桿菌的凍干菌粉。Hayakawa K等人(J Ferment Bioeng,1990,70,404)采用膜技術與發酵罐偶聯，不斷過濾除去乳酸等脅迫成分，實現最高菌體密度高達1011CFU/mL，該方法需耗費大量培養基，且僅限于實驗室水平，很難擴大到生產應用規模。
半固體或固體發酵體系中，中國發明專利(公開號：CN 105132321A)采用由麥麩和豆粕等物質組成的培養基，接種屎腸球菌進行固態發酵，干燥產品中的活菌含量最高為3.8×1010CFU/g。
類似的還有中國專利(公開號：CN 101555510B；CN 101555511B；CN 103421710B；CN 102907563B；CN 103289937B；CN 1212391C)均采用豆粕、麩皮、玉米芯、米糠、花生殼、淀粉、玉米粉、草炭等農業廢棄物或農產品為主要成分的固體培養基，接種微生物，進行高密度發酵，產品中的活菌數基本為1011CFU/g。這類產品主要用于動物飼料或進行藥物等代謝產物生產。
技術實現要素：
為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種益生菌的高密度培養方法及其應用。
本發明采用的技術方案如下：
一、一種益生菌的高密度培養方法：
在含有促進益生菌生長繁殖的促生長因子的培養基中添加多孔材料，培養基與多孔材料的體積比為1：0.001–1：1000，再在培養基中接種益生菌并進行培養，實現益生菌高密度培養。
所述培養為厭氧培養，所接種的益生菌為厭氧或兼性厭氧的微生物。
厭氧培養是在30-42℃下培養12-48h。
培養結束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者內部或者表面和內部，得到干燥后的產品中總活菌數可達1011-1015CFU/g以上。活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
所制備得到的益生菌具有良好的耐熱性、耐酸性及耐藥性等性能。
所述的培養基為液態、半固態或者固態，培養體系可為液體培養、半固體培養和固體培養三種培養方式中的任一種，所述的多孔材料為固態。
所述的培養基為YPD(酵母菌)、雙歧桿菌培養基(青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌)、MRS培養基(嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞氏乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、格氏乳桿菌、片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、蜜蜂球屬、卷曲乳桿菌)、SIIM0012培養基(發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌)、M17培養基(嗜熱鏈球菌)、乳酸菌培養基(乳酸乳球菌乳脂亞種)、腸膜明串珠菌培養基(腸膜明串珠菌腸膜亞種)、丙酸細菌培養基(丙酸桿菌屬)、5oBé麥芽汁瓊脂(德巴利酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬)、血瓊脂培養基(擬桿菌屬、梭桿菌屬)、番茄汁培養基(酒球菌屬)、PDA馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養基(青霉屬)、SICC0070丁酸菌培養基(梭菌屬)、TSA胰蛋白胨大豆瓊脂(氣球菌屬)、肉湯培養基(芽孢桿菌屬)、LB培養基(微球菌屬)等。
所述的培養基中含有促進益生菌生長繁殖的促生長因子。含有促進益生菌生長繁殖的促生長因子如乳清發酵液、膠原蛋白發酵液、馬鈴薯發酵液、海藻提取物、菌菇類發酵液或提取物、豆乳、番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁、冬蟲夏草提取物、靈芝提取物、鐵皮石斛提取物、當歸提取物、銀杏葉提取物、麥芽提取物、參類提取物、黃芪提取物、羅漢果提取物、菊粉、酵母葡聚糖、低聚木糖、維生素、氨基酸、多巴胺、植酸、黃腐酸、腐殖酸、鎂鹽、鋅鹽、錳鹽、鈣鹽、鐵鹽、硒鹽等的一種或多種。
所述的培養基中的多孔材料的平均孔徑大小為1納米-500微米，體積孔隙率為5％-99.9％(v/v)。5％-99.9％(v/v)指的是多孔材料中的孔隙占整個材料的體積比為5％-99.9％。
所述的多孔材料為凝膠材料、氣凝膠材料、泡沫材料、纖維材料、微孔材料、介孔材料或者大孔材料等。
所述的凝膠材料、氣凝膠材料、泡沫材料和纖維材料的平均孔徑從納米級尺寸到微米級尺寸不等；所述的微孔材料的平均孔徑小于2納米，介孔材料的平均孔徑為2-50納米，大孔材料的平均孔徑大于50納米。
所述的多孔材料為天然多糖類及其衍生物、天然蛋白類及其衍生物、合成高分子的均聚物或者共聚物、無機材料等材料中的一種或多種。
天然多糖類如甲殼素、殼聚糖、纖維素、木質素、葡聚糖、瓊脂糖、低聚果糖、大豆低聚糖、魔芋葡甘聚糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚麥芽糖、淀粉、糊精、菊粉、海藻酸及其鹽、右旋糖酐、透明質酸、海藻多糖、褐藻多糖、螺旋藻多糖、地衣多糖、香菇多糖、靈芝多糖、銀耳多糖、阿拉伯膠、果膠、瓜爾膠、黃原膠角叉菜膠等來源于植物、動物、海藻和微生物的多糖及其衍生物。
天然蛋白類如大豆蛋白、綠豆蛋白、小麥蛋白、玉米蛋白、谷蛋白、蠶絲蛋白、蜘蛛絲蛋白、膠原蛋白、乳清蛋白、明膠、酪蛋白酸鈉、纖維蛋白、角蛋白等來源于植物、動物和微生物的蛋白及其衍生物。
合合成高分子的均聚物和共聚物如聚氨基酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚己酸內酯、聚β羥基丁酸酯、聚β羥基戊酸等。
無機材料如珍珠巖、蒙脫土、炭黑、白炭黑、陶瓷等。
所述的多孔材料為以上所述材料的一種或多種，但又不局限于以上材料。
所用的益生菌為對人和(或)動物有益的微生物，如雙歧桿菌屬、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、乳桿菌屬、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種(保加利亞乳桿菌)、德氏乳桿菌亞種、發酵乳桿菌、格氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、鏈球菌屬、嗜熱鏈球菌、乳球菌屬、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、丙酸桿菌屬、酵母屬、德巴利酵母數、假絲酵母屬、球擬酵母屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬、酒球菌屬、消化鏈球菌屬、青霉屬、鏈球屬、梭菌屬、氣球菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、蜜蜂球菌屬、腸球菌屬、微球菌屬、魏斯氏菌屬等的一種或多種，但又不局限于以上菌種。
所述培養基中，多孔材料上接種的益生菌菌液量為0.1％-50％(v/v)。0.1％-50％(v/v)指的是益生菌菌液加入的體積量為加入后整個培養基體積的0.1％-50％。
所述益生菌接種菌液中的菌液的濃度是108-109CFU/mL。
依據本發明的培養方法培養，菌種在培養基中多組分的促進下，其生長繁殖速率大幅提升，培養結束后，干燥即可制得高密度益生菌產品。產品中的總活菌數可達1011-1015CFU/g以上，可用作益生菌發酵劑或益生菌制劑。這種高密度益生菌具有良好的耐熱性、耐酸堿性及耐藥性等性能。
二、所述益生菌在制備食品、食品添加劑、保健品、醫藥、飼料或者環保處理等產品中的應用。
所制備的益生菌在食品、醫藥、飼料、環保處理等領域有廣闊的應用前景。
食品包括餅干、面包、蛋糕等西式糕點，米糕、饅頭、包子、花卷、月餅、粽子等中式糕點，酸奶、乳制品等奶制品，水、果蔬汁、運動飲料等飲料，巧克力、蜜餞、面粉、面粉制品等。
保健品和醫藥包括粉劑和水劑制品。
飼料包括水產、寵物、豬、牛、羊、雞、鴨等動物養育和養殖用飼料。
環保處理產品包括水處理、水凈化等產品。
本發明的有益效果是：
本發明方法可實現益生菌的高密度培養，可直接加工制備成益生菌發酵劑或益生菌制劑。這種方法提高了益生菌生產的生產效率，減少了培養體積，有效降低生產成本。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
下面通過實施例，對本發明專利進一步的描述，但本發明并不限于這些。
本發明的實施例如下：
實施例1：
培養基中加入纖維素/殼聚糖凝膠，凝膠孔隙率為90％，平均孔徑大小為500nm。該培養基中各組分重量百分比為MRS 75％，L-半胱氨酸鹽酸鹽1％，維生素C 1％，胡蘿卜汁5％，香菇提取物10％，豆乳8％。培養基與多孔材料的體積比為1:0.2。
雙歧桿菌接種到培養基中，雙歧桿菌從中國工業微生物菌種保藏管理中心購得，雙歧桿菌采用濃度為109CFU/mL的菌液，接種菌液量為20％。厭氧培養，37℃培養16h，干燥后產品中雙歧桿菌總活菌數可達8×1011-3×1013CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例2：
培養基中加入膠原蛋白/海藻糖多孔膜，多孔膜孔隙率為80％，平均孔徑大小為200nm。該培養基中各組分重量百分比為MRS 80％，蔗糖4％，鎂鹽1％，玉米汁5％，香菇提取物5％，乳清發酵液5％。培養基與多孔材料的體積比為1：1。
鼠李糖乳桿菌接種到培養基中，鼠李糖乳桿菌從中國工業微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購買獲得，鼠李糖乳桿菌采用濃度為109CFU/mL的菌液，接種菌液量為30％。37℃培養24h，干燥后產品中總活菌數可達2×1012-3×1014CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例3：
培養基中加入聚乳酸泡沫，泡沫孔隙率為92％，平均大小為400μm。該培養基中各組分重量百分比為YPD 85％，麥芽提取物4％，維生素1％，平菇提取物5％，靈芝提取物2％，膠原蛋白發酵液3％。培養基與多孔材料的體積比為1：500。
酵母接種到培養基中，酵母菌從中國工業微生物菌種保藏管理中心購得，酵母菌采用濃度為108CFU/mL的菌液，接種菌液量為50％。35℃培養24h，干燥后產品中總活菌數可達3×1012-2×1014CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例4：
培養基中加入蠶絲蛋白/低聚木糖纖維，纖維材料孔隙率為95％，平均孔徑大小為5μm。該培養基中各組分重量百分比為M17 78％，馬鈴薯提取物10％，草菇發酵液5％，當歸提取物5％，番茄汁2％。培養基與多孔材料的體積比為1:50。
植物乳桿菌接種到培養基中，植物乳桿菌從中國工業微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購買獲得，植物乳桿菌采用濃度為109CFU/mL的菌液，接種菌液量為45％。37℃培養36h，干燥后產品中總活菌數可達6×1011-7×1014CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例5：
培養基中加入珍珠巖和細菌纖維素顆粒，孔隙率為65％，孔徑大小為0.2-20μm。該培養基中各組分重量百分比為MRS 78％，低聚木糖5％，海藻提取物5％，草菇發酵液5％，菊粉5％，植酸2％。培養基與多孔材料的體積比為1:0.01。
嬰兒雙歧桿菌、芽孢桿菌、瑞士乳桿菌混合接種到培養基中，上述菌種從中國工業微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購買獲得，均采用濃度為109CFU/mL的接種菌液，接種菌液量分別為15％,15％，15％。37℃培養36h，干燥后產品中總活菌數可達2×1013-1×1015CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例6：
培養基中加入細菌纖維素聚集體、膠原蛋白多孔膜和蒙脫土，孔隙率為70％，孔徑大小為0.02-8μm。該培養基中各組分重量百分比為MRS 70％，豆乳8％，酵母葡聚糖5％，番茄汁5％，香菇發酵液5％，乳清發酵液5％，腐殖酸2％。培養基與多孔材料的體積比為1:100。
芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、丙酸桿菌、糞腸球菌混合接種到培養基中，上述菌種從中國工業微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購買獲得，均采用濃度為109CFU/mL的接種菌液，接種菌液量均為10％。37℃培養30h，干燥后產品中總活菌數可達4×1013-2×1015CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
實施例7：
培養基中加入聚乳酸泡沫、葡聚糖凝膠顆粒和白炭黑，孔隙率為70％，平均孔徑大小為0.2-300μm。該培養基中各組分重量百分比為MRS 50％，YPD20％，乳清發酵液10％，菊粉5％，酵母葡聚糖5％，胡蘿卜汁5％，猴頭菇發酵液3％，黃腐酸2％。培養基與多孔材料的體積比為1:10。
黃酒酵母、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、青春雙歧桿菌、糞腸球菌混合接種到培養基中，上述菌種從中國工業微生物菌種保藏管理中心公眾途徑購買獲得，酵母采用109CFU/mL的接種菌液，其它菌種均采用濃度為109CFU/mL的接種菌液，接種菌液量均為8％。37℃培養36h，干燥后產品中總活菌數可達8×1013-6×1015CFU/g，活菌數受干燥方法等因素的影響，冷凍干燥的產品中活菌數更高。
由上述實施例可見，本發明方法具有其突出顯著的技術效果，能進行益生菌的高密度培養，提高了益生菌生產的生產效率，減少了培養體積，有效降低生產成本。