一種優化的水稻秈粳性檢測體系和方法與流程

本發明涉及一種檢測體系，尤其涉及一種優化的水稻秈粳性檢測體系和方法。

背景技術：

亞洲栽培稻(Oryza sativa L.)分為秈稻和粳稻兩個亞種。對水稻秈粳分化研究，可以從形態學標記、生化標記和分子標記等方面進行。由程侃聲創立的亞洲稻秈粳亞種程式指數鑒別法(程侃聲等，1984)簡單易行，但受生長環境和水稻生長周期等因素限制。相比于形態學和生化方法，由于分子標記直接反映核苷酸序列上的可遺傳變異，可以更加準確高效地鑒定秈粳亞種，準確揭示遺傳差異。隨著秈稻93-11和粳稻日本晴基因組序列測定的完成，Shen等(2004)利用生物信息學方法比對了二者的全基因組序列，構建了93-11和日本晴序列差異的數據庫，其中包含了479，406個插入缺失(InDel)。通過典型的秈稻和粳稻(93-11和日本晴)DNA序列比對，根據插入缺失差異片段進行引物設計，這些標記就很可能與秈粳分化有關。已有研究利用InDel標記揭示稻屬植物秈粳分化；SSR標記具有基因組分布廣泛、檢測技術簡單和費用低等特點，也有不少研究利用該類型標記分析水稻秈粳分化。

在利用已經公布的秈粳性專一標記進行水稻秈粳屬性的判別過程中，發現存在以下問題：(1)有的秈粳性標記在檢測群體中容易出現偏態分布，如在粳稻群體中也出現大量的秈型條帶(圖1)；有些秈粳性標記的秈粳性區分性不高，如在秈稻群體中，秈型帶和粳型帶出現的頻率幾乎一樣(圖1)；有些秈粳性標記的多態性很高，在群體中出現多種帶型，不具備秈型和粳型特異性(圖1)；(2)有些標記擴增效果并不好，帶型模糊；(3)雖然這些秈粳性標記的擴增產物以及產物大小差異并不一致，電泳分型所用的時間不同，但是并沒有具體的電泳參考時間；(4)傳統的PAGE膠電泳后，都是采用銀染的方法來進行判別帶型，操作過程比較繁瑣耗時；(5)秈粳屬性的判別只是基于與對照品種9311和日本晴的比較，存在誤判的風險。因此，為了高效準確地利用分子標記來檢測秈粳性，有必要參照水稻基因組中秈粳特異的序列開發一系列標記，并針對這些標記，建立一套高效準確的檢測體系，涉及到擴增、電泳檢測以及秈粳屬性判別方法等環節。

技術實現要素：

本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種優化的水稻秈粳性檢測體系和方法。

一種優化的水稻秈粳性檢測體系，包括分子標記系統、擴增系統、電泳系統及凝膠成像系統；

所述分子標記系統用于一組秈粳專一性高的分子標記；

所述擴增系統用于進行PCR擴增；

所述電泳系統用于進行PAGE膠電泳；

所述成像系統用于成像檢測帶型。

一種優化的水稻秈粳性檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、設計一組秈粳專一性分子標記；

步驟2、給每對分子標記提出最適合的引物濃度，退火溫度以及參考的電泳時間，用這些秈粳專一標記以15ul的擴增體系進行PCR擴增；

步驟3、PCR擴增結束后，在電壓為105V的情況下，用電泳系統進行8.0％的PAGE膠電泳，電泳時間1h30min～2h40min；

步驟4、待PCR擴增以及PAGE膠電泳結束后，將PAGE膠放入純水溶解的10^-4GoldView溶液中染色10～15min，然后用凝膠成像系統檢測帶型；

步驟5、根據檢測帶型來進行秈粳性的判別。

優選的，所述擴增系統包括：

優選的，所述擴增系統的擴增程序為：

94℃下預變性5min后；

94℃下變性30s；

51～60℃下退火30s；

72℃下延伸45s，35個循環；

最后72℃下延伸8min。

優選的，所述水稻秈粳性判別方法，包括以下步驟：首先通過聚類分析，確定秈粳屬性，然后通過與秈稻和粳稻測驗種的相似系數來確定秈性度，具體過程如下：將檢測品系的擴增帶型按照某一等位基因的有無分別賦值0和1，對所有品系的每個檢測標記都統計秈性和粳性2種特征帶的有無，然后用NTsys-2.1軟件進行秈粳性的聚類分析，聚類分析時，先選用DICE方法計算所有品系的相似系數矩陣，再選用SHAN模塊進行聚類，聚類方法為UPGMA，然后用Graphics程序作圖，得到秈粳性聚類結果。

優選的，所述判別方法包含秈性度指標，具體計算公式為：Di＝Si/Si+Sj；

S_i＝∑S_Ki/N_i；S_j＝∑S_Kj/N_j；式中Di為秈性度，Si/Sj為某待測系與秈型/粳型測驗種群的平均相似系數，SKi/SKj為某被測系與各秈/粳型測驗種的相似系數，其中Ki/Kj＝1……Ni/Nj，Ni/Nj為秈/粳型測驗種的個數；S是指采用DICE方法計算出的2個品系的相似系數。計算出的秈性度對應秈粳屬性，具體標準如下：Di≤0.25則為粳，0.25<Di≤0.5則為偏粳，0.5<Di≤0.75則為偏秈，0.75<Di則為秈。

本發明提出的一種優化的水稻秈粳性檢測體系，針對引物的不同特性，提出了優化的PCR擴增以及檢測體系，檢測帶型清晰明顯，體系采用GoldView水溶液中染色，代替了傳統的PAGE膠銀染的方法，操作過程更加簡便，擴增效率和檢測效率都得到了提升，本發明還提出了一種水稻秈粳性判別方法，設計的秈粳性判別標記專一性強，只出現一條秈型或粳型的特異帶型，而且特異條帶在秈粳群中出現的頻率都在70.0％以上，特異條帶在秈稻和粳稻群體中出現頻率都在90.0％以上的有13對引物，本發明基于測試材料與一組秈稻測驗種和粳稻測驗種的比較來確定其秈粳屬性的思路，提出用秈性度來衡量秈粳性，比較的結果更加客觀全面。

附圖說明

圖1為已公布的部分秈粳性特異標記在待測品系中的擴增帶型，圖中的a和b分別是秈稻9311和粳稻日本晴；

圖2為本發明設計的部分秈粳性專一標記在待測品系中的擴增帶型，圖中的a和b分別是秈稻9311和粳稻日本晴；

圖3為檢測品系的秈粳性聚類。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步解說。

參照圖1～3，本發明提出的一種優化的水稻秈粳性檢測體系，包括分子標記系統、擴增系統、電泳系統及凝膠成像系統；

所述分子標記系統用于一組秈粳專一性高的分子標記；

所述擴增系統用于進行PCR擴增；

所述電泳系統用于進行PAGE膠電泳；

所述成像系統用于成像檢測帶型。

一種優化的水稻秈粳性檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、選取92份秈粳(其中秈稻47份，粳稻45份，表3)做專一性標記(表1)。

表1秈粳專一標記的序列以及染色體位置

注：a物理位置是參考日本晴的序列(IRGSP-1.0)錨定的。

步驟2、給每對分子標記提出最適合的引物濃度，退火溫度以及參考的電泳時間，用這些秈粳專一標記以15ul的擴增體系進行PCR擴增；所述擴增體系包括：

產物擴增用PCR儀進行，擴增程序是：

94℃下預變性5min后；

94℃下變性30s；

51-60℃下退火30s(不同引物的退火溫度有變動，表2)；

72℃下延伸45s，35個循環；

最后72℃下延伸8min。

步驟3、PCR擴增結束后，用電泳系統進行8.0％的PAGE膠電泳(電壓105V)，電泳時間1h30min～2h40min。

表2秈粳專一標記的退火溫度，用量以及電泳檢測時間

注：a合適用量是指15ul的擴增體系中引物濃度為10umol/L引物的用量；b是電泳時間是指用8％PAGE膠，Bio-Rad垂直電泳系統中用105V進行電泳可以清晰分辨秈粳帶型的時間。

步驟4、待PCR擴增以及PAGE膠電泳結束后，取下PAGE膠放入10^-4Goldview溶液中染色10～15min,然后用凝膠成像系統檢測帶型。

步驟5、根據專一帶型的頻率計算公式檢測帶型進行秈粳性的判別，在秈稻/粳稻群中專一條帶出現頻率70％以上的認為是秈型/粳型條帶；所用的秈粳專一標記在秈稻群和粳稻群出現的頻率如下(表4，圖2)。

計算專一帶型的頻率公式為：

秈型專一帶型頻率＝[2×純合秈型條帶數+秈性條帶數(雜合帶型)]/2×秈稻數；粳型專一帶型頻率＝[2×純合粳型條帶數+粳型條帶數(雜合帶型)]/2×粳稻數

表3用于秈粳性檢測的品系

表4秈粳專一標記在秈稻和粳稻群體中出現的頻率

根據統計的秈粳專一標記的帶型結果，對這92份品系進行秈粳性聚類分析，聚類結果與已知的秈粳性屬性完全吻合(圖3)。

根據聚類圖，選取10份品系(5份秈稻，5份粳稻)，分別以秈稻測驗種群(華粳秈74、IR64、三黃占-2、9311)和粳稻測驗種群(南洋占、IR66897B、空育131、日本晴)，對這些品系的秈性度進行了計算(表5)。

表5檢測品系的秈性度及秈粳屬性

注：判別標準為：Di≤0.25則為粳，0.25<Di≤0.5則為偏粳，0.5<Di≤0.75則為偏秈，0.75<Di則為秈。

本發明提出的一種優化的水稻秈粳性檢測體系，針對引物的不同特性，提出了優化的PCR擴增以及檢測體系，檢測帶型清晰明顯，體系采用GoldView水溶液中染色，代替了傳統的PAGE膠銀染的方法，操作過程更加簡便，擴增效率和檢測效率都得到了提升，本發明還提出了一種水稻秈粳性判別方法，設計的秈粳性判別標記專一性強，只出現一條秈型或粳型的特異帶型，而且特異條帶在秈粳群中出現的頻率都在70.0％以上，特異條帶在秈稻和粳稻群體中出現頻率都在90.0％以上的有13對引物，本發明基于測試材料與一組秈稻測驗種和粳稻測驗種的比較來確定其秈粳屬性的思路，提出用秈性度來衡量秈粳性，比較的結果更加客觀全面。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。