用于得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的質粒載體和方法與流程

本發明涉及植物育種領域，更特別地，涉及用于得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的質粒載體和方法。

背景技術：

植物經常處于逆境脅迫的環境中，植物應對脅迫常見的響應就是促進活性氧的積累(Halliwell et al.，1998)。RCD1蛋白是植物逆境和生長發育過程中一個重要的調節因子(Jaspers et al.，2009；Teotia S et al.，2009)。SRO是植物特有的小蛋白家族，在擬南芥中，該家族共有六個成員，包括RCD1和5個SROs(SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5(Jaspers et al.，2009)。RCD1蛋白包含一個保守的球狀WWE結構域和一個PARP(poly ADP-ribose polymerase)結構域，WWE結構域可以調節特定蛋白質之間的相互作用(Aravind et al.，2001)。

土壤鹽漬度是一個影響植物生長和農業生產力的重要環境因素，鹽漬土中的Na⁺在植物體細胞質中過度積累對植物生長發育是不利的(Liu et al.，2001)。SOS(saltoverly sensitive)途徑負責維持植物體內的Na⁺平衡(Zhu et al.，2002)，Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白SOS1定位于質膜上，它可以將細胞內的Na⁺排出(Qiu et al.，2002)。擬南芥中，過量表達SOS1可以提高抗鹽脅迫能力。前人研究表明，擬南芥SOS1和RCD1在鹽脅迫和氧化脅迫時發生相互作用，共同參與植物的抗鹽和抗氧化途徑(Katiyar-Agarwal et al.，2006)。

植物體內對氧化脅迫的響應有利于植物的正常生長發育。前人研究表明酵母的Yap1(Yeast activator proteins1)參與酵母細胞對H₂O₂引起的氧化脅迫反應，它作為H₂O₂轉錄因子在氧化脅迫信號中扮演重要角色(Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997)。植物中有許多參與氧化脅迫的相關因子已被深入研究，比如致病相關蛋白(RP)、抗壞血酸氧化酶(APX)、苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)等(Teotia et al.，2009)。Belles-Boix等研究表明，擬南芥RCD1可以增強酵母抗氧化能力并互補Yap1突變酵母表型，表明AtRCD1在擬南芥的氧化脅迫中扮演重要的角色(Belles-Boix et al.，2000)。擬南芥突變體rcd1-1表現出對臭氧和超氧化物超敏感，引起超氧根離子的積累，并在短時間內傳播病態(Overmyer et al.，2005)。此外，突變體還表現出對脫落酸、乙烯、茉莉酸甲酯敏感度降低，并且這幾種植物激素調節基因的表達量也發生了改變(Overmyer et al.，2000)。因此，AtRCD1在調節擬南芥的生長發育及對環境脅迫的反應中發揮重要作用。

擬南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]結構域上與AtRCD1具有高度保守性(Jaspers et al.，2009)。研究表明，AtSRO1與AtRCD1之間在功能上存在部分功能冗余,AtSRO1同樣參與到非生物脅迫反應當中(Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000)，AtSRO5表達明顯受鹽脅迫誘導(Borsani et al.，2005)，AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也顯示出對多種非生物脅迫下轉錄子水平的變化,比如強光、鹽處理及O₃(Jaspers et al.，2010)。然而AtSRO4的研究相對較少，沒有相關類似的功能。

在擬南芥中RCD1已經進行了克隆和功能鑒定，但是在蘋果中的尚未見報道。因此，需要一種得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的方法。

技術實現要素：

為解決以上技術問題，本發明提供了一種用于得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的質粒載體，其包含MdRCD1基因表達框和篩選標記，所述MdRCD1基因表達框由包含在植物中組成型表達的強啟動子和由所述強啟動子控制表達的MdRCD1基因，所述MdRCD1基因表達的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

優選地，所述MdRCD1基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

優選地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

優選地，所述質粒載體由所述MdRCD1基因順著CaMV35S啟動子的轉錄方向插入到PRI101質粒的SalⅠ和EcoRⅠ之間得到。

本發明還提供了一種用于得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的方法，其包括以下步驟：將所述質粒載體導入植物的愈傷組織細胞中，篩選攜帶有所述質粒載體的愈傷組織細胞，并將其培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強抗性的植物。

優選地，所述方法包括以下步驟：

1)用所述質粒載體轉化農桿菌LBA4404，得到攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404；

2)用所述攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404轉化所述植物愈傷組織細胞共培養，得到被所述質粒載體轉化的植物；

3)通過所述篩選標記篩選被所述轉化的植物愈傷組織細胞；

4)通過組織培養將篩選得到的所述被轉化的植物愈傷組織細胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強抗性的植物。

優選地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

優選地，所述植物是蘋果。

優選地，所述質粒載體通過將所述MdRCD1基因順著CaMV35S啟動子的轉錄方向插入到PRI101質粒的SalⅠ和EcoRⅠ之間來得到。

優選地，所述方法包括以下步驟：

1)通過電轉法將所述質粒載體轉入LB4404農桿菌中，通過卡那霉素和PCR篩選攜帶有所述質粒載體的LB4404；

2)然后將攜帶有所述質粒載體的LB4404接種于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液體培養基中，于28℃、200rpm下振蕩培養至OD₆₀₀＝0.6-0.8，離心收集菌體，用MS液體培養基重懸稀釋20倍，得到轉化用的菌液，將蘋果愈傷組織在所述轉化用的菌液中浸泡10min，期間多次搖晃，除去所述轉化用的菌液，將經浸泡的蘋果愈傷組織轉移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基中，于26℃黑暗下培養2d；

3)將步驟2)得到蘋果愈傷組織用無菌雙蒸水清洗2-3次后，均勻地鋪到含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基的篩選培養基上進行篩選，得到轉染了所述質粒載體的蘋果愈傷組織細胞；

4)使用含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基將所述轉染了所述質粒載體的蘋果愈傷組織細胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強抗性的植物。

附圖說明

圖1為蘋果MdRCD1基因編碼區全長的RT-PCR擴增產物的電泳照片；

圖2為轉基因蘋果愈傷組織中MdRCD1的相對表達量，以王林蘋果愈傷組織中的MdRCD1相對表達量為1。

具體實施方式

以下結合實例和附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

基于蘋果愈傷組織是單細胞組織，具有繁殖能力強、離體培養再生能力強、遺傳轉化效率高等優點，是蘋果研究領域普遍的研究材料。

1.對蘋果中MdRCD1基因的研究

發明人檢測了MdRCD1基因在嘎啦蘋果中無脅迫條件下和高鹽濃度下的表達情況，發現MdRCD1基因在高鹽濃度下的上調表達，暗示MdRCD1基因可能蘋果的鹽脅迫抗性有關。

2.蘋果中MdRCD1基因的克隆以及表達載體的構建

1)發明人通過使用引物1：5’-ATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和引物2：5’-CTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:4)，通過RT-PCR從嘎啦蘋果擴增得到MdRCD1基因片段(圖1)，將其連接到pMD18-T質粒上，得到pMD18-T-MdRCD1質粒，經測序得到正確的克隆，該基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示，基因表達產物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)使用引物3：5’-GTCGACATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:5，下劃線標示SalⅠ酶切位點)和引物4：5’-GAATTCCTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:6，下劃線標示EcoRⅠ酶切位點)，從上述質粒PCR擴增得到帶有SalI和EcoRI酶切位點的MdRCD1基因片段；

3)將上述片段經SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接到同樣經SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切的PRI101質粒質粒上，篩選正確的陽性克隆，得到MdRCD1基因表達質粒載體。

3.MdRCD1基因表達質粒載體轉化LB4404

通過電轉法將MdRCD1基因表達質粒載體轉入LB4404農桿菌中，通過卡那霉素和PCR篩選攜帶有所述質粒載體的LB4404；

4.農桿菌轉化王林蘋果愈傷組織細胞

將攜帶有MdRCD1基因表達質粒載體的LB4404接種于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液體培養基中，于28℃、200rpm下振蕩培養至OD₆₀₀＝0.6-0.8，離心收集菌體，用MS液體培養基重懸稀釋20倍，得到轉化用的菌液，將蘋果愈傷組織在所述轉化用的菌液中浸泡10min，期間多次搖晃，除去所述轉化用的菌液，將經浸泡的蘋果愈傷組織轉移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基中，于26℃黑暗下培養2d；

得到蘋果愈傷組織用無菌雙蒸水清洗2-3次后，均勻地鋪到含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基的篩選培養基上進行篩選，得到轉染了所述質粒載體的蘋果愈傷組織細胞；

使用含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養基將所述轉染了所述質粒載體的蘋果愈傷組織細胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強抗性的植物。

5.轉基因蘋果愈傷組織抵抗鹽脅迫的分析

(1)MdRCD1基因在轉基因蘋果愈傷中的相對表達量

利用篩選培養基(含100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素)篩選抗卡那霉素陽性的候選轉基因株系，共獲得4個35S:MdRCD1陽性株系(1-4)；為進一步鑒定轉基因株系，在進行繼代培養時，每株系各取0.1g左右的愈傷組織，提取相應的RNA，反轉錄并進行定量qRT-PCR檢測(具體方法見實例3)，以確定這些株系中MdRCD1基因的表達水平。結果顯示，MdRCD1基因在1-4中均過量表達(圖2)。由于株系1中表達量較高，選擇株系1繼續擴繁，為MdRCD1基因的進一步功能鑒定準備材料。

為了進一步確定轉基因愈傷的功能，發明人對轉基因蘋果愈傷進行抗鹽能力分析。

(3)逆境處理：選擇生長狀態良好且均一的王林和蘋果愈傷，進行不同濃度的鹽脅迫逆境處理。

(4)結果觀察：15天以后，對王林愈傷和轉基因愈傷在鹽脅迫條件下的生長狀況。結果發現：WL和MdRCD1-OX在0mmol·L-1的培養基上生長狀態基本一致，隨著鹽濃度的提高，它們的長勢越來越差，但是可以觀察到，過量表達MdRCD1的愈傷組織的長勢明顯好于WL愈傷。這些結果充分說明了MdRCD1基因是一個抗鹽相關的基因，該基因的過量表達可以提高轉基因蘋果愈傷的抗鹽能力。

根據上述技術，本發明從蘋果中克隆了基因MdRCD1，通過遺傳轉化蘋果愈傷鑒定了其可以明顯提高抗鹽性，為進一步研究MdRCD1的功能奠定了基礎，使其作為蘋果砧木抗逆性分子改良的候選基因。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。