一種熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法與流程

本發明屬于分子生物學與細胞生物技術領域，具體涉及一種熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法。

背景技術：

在同一條核酸鏈上起調控基因表達作用的核酸序列稱為順式作用元件，包括啟動子、增強子、衰減子等；轉錄因子也被稱為反式作用因子，是一種特異性作用于啟動子區域順式作用元件從而能夠對不同核酸鏈上的基因表達起調控作用的蛋白質分子。轉錄因子要發揮作用，必須具有一定的活性，這依賴于轉錄因子的數量及其與順式作用元件結合的親和力。可見，檢測轉錄因子的活性，對于闡明某個基因的表達調控的規律，具有重要意義，因而被廣泛應用于生物學和醫學研究中。

特別是，真核生物基因的表達調控是當前分子生物學領域最前沿的研究方向之一，而轉錄水平的調控是基因表達過程中最為重要的步驟。由于蛋白質與蛋白質，蛋白質與DNA之間的相互作用，以及一些復雜大分子復合物的形成，導致真核生物轉錄水平的調控更為復雜；并且，轉錄因子及其表達調控的檢測是研究其功能的重要前提基礎，高效、特異、靈敏、簡便的檢測方法對于研究真核生物基因表達具有重要的作用。

目前，用于檢測轉錄因子活性的最為常用方法有熒光定量PCR檢測，該檢測方法將轉錄因子表達載體轉染到真核細胞內，并通過RT-PCR方法檢測轉錄因子的表達水平，或通過蛋白表達水平間接反映轉錄活性；其中，RT-PCR檢測方法需要將轉錄因子轉染真核細胞，通過提取細胞中總RNA，進行PCR檢測；然而，RNA對溫度敏感且易降解，檢測時需要設計多對引物進行目的RNA擴增，同時選取合適的內參及正負對照，上述這些缺陷導致檢測的結果不能真實反映轉錄因子的表達活性，同時可重復性差，檢測過程耗時較長。

因此，現有技術中也提供了提取細胞中總的蛋白質，并通過免疫印跡法(Western blotting)檢測特定蛋白質的表達量，從而從側面反應轉錄因子表達量；然而，該方法的操作更加繁瑣，并且，由于蛋白提取過程中不可避免的損失以及降解，所測得的結果并不能真實反映真核細胞中轉錄因子的轉錄表達量，此外，整個實驗的操作過程不可控因素比較多，因此相較于流行的RT-PCR檢測方法而言，更加不適合于檢測轉錄因子的表達活性。

此外，中國專利CN1637417A另外提供了一種轉錄因子活性檢測方法，該方法是基于ELISA檢測方法的改進，其特別之處是采用一種新的雙鏈寡核苷酸探針構建，以克服ELISA檢測方法雙鏈寡核苷酸探針的設計構建所帶來的不足。然而，該新型ELISA檢測方法仍然存在操作繁瑣且耗時較長的技術問題。

借助于熒光素酶報告基因系統實施的熒光素酶檢測(luciferase assay)目前已被廣泛應用于真核基因表達和細胞生理學研究，其應用包括受體活性、細胞內信號轉導、mRNA加工和蛋白質折疊。建立熒光素酶報告基因檢測系統簡單、方便，并且熒光素酶持久穩定，因而可被用于檢測轉錄因子與其啟動子中的特異順式作用元件結合的研究。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的上述問題，即為了提供一種操作簡單、耗時短、高通量、可重復性高且準確度高的轉錄因子表達活性的檢測方法，發明人擬充分利用熒光素酶檢測，即借助于熒光素酶報告基因系統，提供一種新的檢測轉錄因子表達活性的方法。

具體地，本發明記載的技術方案提供了一種熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：根據待檢測表達活性的轉錄因子的蛋白質組成，確定能與所述轉錄因子結合的靶基因啟動子序列，將篩選到的靶基因啟動子的特定片段插入熒光素酶報告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達序列的上游，從而制得包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體；

步驟(2)：進行目標細胞的培養與鋪板，得到待轉染細胞；

步驟(3)：配制脂質體、所述包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體和轉錄因子表達質粒的混合物，使用該混合物轉染步驟(2)所制得的待轉染細胞，獲得被轉染的細胞；

步驟(4)：將細胞裂解緩沖液加至所述被轉染的細胞，進行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測緩沖液中進行熒光素酶表達強度檢測，并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性。

其中，所述裂解指的是細胞裂解緩沖液A對細胞膜的裂解。

在上述方法的步驟(1)中，可以運用已知的NCBI數據庫以及TargetScan生物學軟件等進行預測與確定能與所述轉錄因子結合的靶基因啟動子序列。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述熒光素酶報告基因載體為啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic；該啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic優選購自美國Promega公司。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述步驟(2)包括：將目標細胞培養于含有胎牛血清、雙抗的完全培養基中，并維持單層貼壁生長，于37℃下，在5％CO₂的培養箱中過夜培養，待細胞匯合度達到80％后，則可開始實施步驟(3)。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述步驟(3)中轉染的操作為：將所述待轉染細胞以每孔100000個接種于24孔培養板中，將所述混合物與培養基加入該培養板，置于37℃下的5％CO₂培養箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養基轉染培養18～24h。

本發明還提供了一種細胞裂解緩沖液，用于上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述細胞裂解緩沖液具有以下組分與配比：

0.2M KH₂PO₄ 4-4.5ml，如4.1-4.45ml、4.15-4.4ml、4.2-4.35ml、4.25-4.3ml；

0.2M K₂HPO₄ 44-48ml，如44.5-47ml、45-46.5ml、45.75-46.25ml；

MQ H₂O 48-52ml，如48.5-51.6ml、48.8-50.4ml、49.2-49.8ml；

Triton X-100 200μl。

本發明還提供了一種熒光素酶活性檢測緩沖液，用于上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述熒光素酶活性檢測緩沖液具有以下組分與配比：

0.25M Tris pH7.8 700μl

1M MgSO₄ 100-115μl，如102-112μl，103-110μl，104-108μl，105-107μl；

dH₂O 5870-5880μl，如5872-5879μl，5875-5878μl；

0.25M ATP 250-300μl，如255-290μl，260-285μl，270-280μl，

Luc 43-50μl，如44-48.5μl，45-48μl，46-47μl。

值得說明的是，所述細胞裂解緩沖液和所述熒光素酶活性檢測緩沖液中，各組分的配比雖然以數值與單位相結合的形式示出，但是，并不限于以上數值與單位相結合的形式，換言之，實際配制所述細胞裂解緩沖液和所述熒光素酶活性檢測緩沖液中的各組分時，只要保證各組分用量比例符合上述配比即可。

優選地，在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，所述步驟(4)包括：

(4.1)吸棄所述培養板中的培養基，加入400μl/孔預冷的PBS，沖洗所述被轉染的細胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養板的每個孔內加入50μl預先配制好的所述細胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標記的1.5ml EP管中，用離心機在4℃下以12000rpm的轉速離心10min，得上清液；

(4.4)現配所述熒光素酶活性檢測緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內，檢測熒光素酶表達強度數據；

(4.6)檢測熒光素酶濃度，校正；并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性。

在上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中，由于所述轉錄因子的表達活性表現為能夠激活靶基因啟動子，因此，如果所述轉錄因子能夠激活靶基因啟動子，則熒光素酶基因就會表達，并且如圖1所示，熒光素酶會催化熒光素酶活性檢測緩沖液B中的熒光素(Luc)反應而產生熒光，而熒光素酶的表達量與所述轉錄因子的表達活性成正比。正是由于這一基因表達機制與相應正比關系的存在，上述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法才能得以實施。

由此可見，本發明通過分子克隆的方法構建靶基因啟動子區域熒光素酶報告基因質粒，用于檢測細胞內轉錄因子的表達水平，進而應用于真核細胞轉錄因子表達機制的研究。

綜上所述，發明人成功實施了一種熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法，該方法巧妙利用了熒光素酶自身持久穩定并且易于檢測的特性，首先將包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體與轉錄因子表達質粒共同轉染至細胞，繼續培養被轉染的細胞后，將一定數量的細胞用細胞裂解緩沖液裂解，收集含有熒光素酶的裂解液，接著離心取上清液，然后在熒光素酶活性檢測緩沖液內實時檢測出熒光素酶表達強度數據，并同時測得熒光素酶濃度，校正后，即可計算得到所述轉錄因子的表達量，即所需要檢測的轉錄因子的表達活性；由此可見，相較于現有技術，該方法的整個操作過程更加簡單易行，耗時更短，通量更高，并且具有較高的可重復性與準確度。

此外，本發明還提供了一種細胞裂解緩沖液和熒光素酶活性檢測緩沖液，用于所述的熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法，相較于購買相應的熒光檢測工作液而言，成本更加低廉；當前，Promega公司壟斷了熒光素酶表達活性檢測行業絕大部分市場，其生產的1000次熒光檢測試劑盒(含熒光檢測工作液)的價格約為12000元；平均每個樣品檢測的價格達120元；100次檢測至少160-200元/樣左右；本發明所提供的熒光檢測工作液的成本價格約為3000元，可以實施約3300次，相同價格下，可實施檢測的次數是國外相應產品的12-15倍，因而具有極佳的價格優勢，經濟實惠。因此，本發明所提供的熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法、以及細胞裂解緩沖液和熒光素酶活性檢測緩沖液，擁有現有的轉錄因子表達活性檢測方法所不具備的上述綜合優勢，該方法在表達活性檢測方面具有廣闊的應用前景，并且具有優異的市場潛力。

附圖說明

圖1為本發明所述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中熒光素酶催化機理示意圖，其中示出了熒光素發光反應式，可見，熒光素在熒光素酶催化下，且在Mg²⁺及ATP作用下發出了熒光；

圖2為本發明所述熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法中優選的pGL3/4-basic載體的圖譜。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下實施方式。

本發明提供了一種熒光素酶報告基因系統檢測轉錄因子表達活性的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：根據待檢測表達活性的轉錄因子的蛋白質組成，確定能與所述轉錄因子結合的靶基因啟動子序列，以基因組DNA為模板，利用PCR反應進行擴增，獲得靶基因啟動子調控區片段；然后，將所述靶基因啟動子調控區片段進行酶切純化，篩選重組子；最后，將篩選到的靶基因啟動子的特定片段插入熒光素酶報告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達序列的上游，從而制得包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體；

步驟(2)：進行目標細胞的培養與鋪板，得到待轉染細胞；

步驟(3)：配制脂質體、所述包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體和轉錄因子表達質粒的混合物，使用該混合物轉染步驟(2)所制得的待轉染細胞，獲得被轉染的細胞；

步驟(4)：將細胞裂解緩沖液A加至所述被轉染的細胞，進行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測緩沖液B中進行熒光素酶表達強度檢測，并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性。

在一個優選實施例中，所述熒光素酶報告基因載體為啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic。其中，pGL3/4-basic載體圖譜如圖2所示。

在一個優選實施例中，所述步驟(2)包括：將目標細胞培養于含有胎牛血清、雙抗的完全培養基中，并維持單層貼壁生長，于37℃下，在5％CO₂的培養箱中過夜培養，待細胞匯合度達到80％后，則可開始實施步驟(3)。

在一個優選實施例中，所述步驟(3)中轉染的操作為：將所述待轉染細胞以每孔100000個接種于24孔培養板中，將所述混合物與培養基加入該培養板，置于37℃下的5％CO₂培養箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養基轉染培養18-24h。

在一個優選實施例中，所述細胞裂解緩沖液A具有以下組分與配比：

在一個優選實施例中，所述熒光素酶活性檢測緩沖液B具有以下組分與配比：

在一個優選實施例中，所述步驟(4)包括：

(4.1)吸棄所述培養板中的培養基，加入400μl/孔預冷的PBS，沖洗所述被轉染的細胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養板的每個孔內加入50μl預先配制好的所述細胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標記的1.5ml EP管中，用離心機在4℃下以12000rpm的轉速離心10min，得上清液；

(4.4)現配所述熒光素酶活性檢測緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內，檢測熒光素酶表達強度數據；

(4.6)檢測熒光素酶濃度，校正；并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性。

下述實施例中的步驟如無特別說明均為常規操作，所述試劑如無特別說明均能從公開商業途徑獲得。

實施例1

購買的主要試劑與儀器：

啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic(質粒)購自美國Promega公司；PBS(磷酸鹽緩沖液)購自HyClone公司；Lipofectamin^TM2000脂質體購自Invitrogen公司；熒光表達強度檢測儀為Promega Glomax 20/20生物/化學發光檢測儀。試劑配制：

100ml細胞裂解緩沖液A(實驗前預先配制)，其中：

6988μl熒光素酶活性檢測緩沖液B(以2*24孔為例，實驗開始后現配)，其中：

開始實驗，操作步驟如下：

(1)：明確轉錄因子的蛋白質組成，確定能與所述轉錄因子結合的靶基因啟動子序列，以基因組DNA為模板，利用PCR反應進行擴增，獲得靶基因啟動子調控區片段；然后，將所述靶基因啟動子調控區片段進行酶切純化，篩選重組子；最后，將篩選到的靶基因啟動子的特定片段插入熒光素酶報告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達序列的上游，從而制得包含靶基因啟動子的熒光素酶報告基因載體；

(2)：將目標細胞培養于含有10％胎牛血清且含有雙抗的完全培養基中，并維持單層貼壁生長，于37℃下，在5％CO₂的培養箱中靜置過夜培養，觀察目標細胞生長狀態，待目標細胞生長至對數期時分別用臺盼藍計數，以100000每孔的細胞量接種于24孔培養板中，置于37℃下的5％CO₂培養箱中培養，待細胞匯合度達到80％時，得到待轉染細胞，開始實施以下步驟(3)；

(3)：配制包含靶基因啟動子的啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic/轉錄因子表達質粒/Lipofectamin^TM2000脂質體的混合物，使用該混合物轉染所述待轉染細胞，獲得被轉染的細胞，具體包括以下步驟：

(3.1)將300ng的包含靶基因啟動子的啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic、60ng的轉錄因子表達質粒，溶于50μl無血清培養基中稀釋，室溫下孵育5min；

(3.2)將2μl的Lipofectamin^TM2000脂質體以同樣的方式溶于50μl無血清培養基中稀釋，室溫下孵育5min；

(3.3)輕柔混勻(3.1)與(3.2)中配制的試劑，室溫靜置20～30分鐘，得到包含靶基因啟動子的啟動子增強子報告載體pGL3/4-basic/轉錄因子表達質粒/Lipofectamin^TM2000脂質體的混合物；

(3.4)吸棄24孔培養板中的原培養基，然后用PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗3次，將所述待轉染細胞以每孔100000個接種于該24孔培養板中，每孔加入500μl無血清培養基，再將所述混合物逐滴加入該培養板中，并輕輕搖板均勻，置于37℃下的5％CO₂培養箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養基轉染培養18-24h，獲得被轉染的細胞；

(3.5)對照組用pGL3/4-basic空載體實施平行轉染，每組均做3副孔重復3次以保證實驗結果的準確性。

(4)：將細胞裂解緩沖液A加至所述被轉染的細胞，進行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測緩沖液B中進行熒光素酶表達強度檢測，并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性，具體操作如下：

(4.1)吸棄所述被轉染的細胞所在培養板中的培養基，加入400μl/孔預冷的PBS，沖洗所述被轉染的細胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養板的每個孔內加入50μl預先配制好的所述細胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標記的1.5ml EP管中，用離心機在4℃下以12000rpm的轉速離心10min，得上清液；

(4.4)現配所述熒光素酶活性檢測緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內，檢測熒光素酶表達強度數據；

(4.6)檢測熒光素酶濃度，校正；并計算出熒光素酶的表達量，從而檢測出所述轉錄因子的表達活性。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對該實用進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。