一種長鏈非編碼RNAlnc?HR1用途及克隆方法與流程

技術領域：
本發明涉及醫藥
技術領域：
，尤其涉及一種長鏈非編碼RNAlnc-HR1、用途及其克隆方法。
背景技術：
：臨床慢性肝炎、脂肪肝等肝病，主要是由于病毒感染、不合理的飲食、致病細菌感染、藥物損傷等引發的脂類在肝臟的代謝異常，從而引發相關的癥狀。針對大量中性脂類在肝臟內的大量累積，可能應發肝纖維化甚至造成肝硬化肝細胞肝癌等嚴重的肝病，目前的治療方法首先是給予患者降脂酶，降低肝臟內脂類的積累，最終恢復肝臟和血液中脂類的含量達到正常值。但是對于常用的降脂藥物，只能降低肝臟和血液中脂類的含量，并不能直接抑制脂類的合成，需要長期用藥。技術實現要素：本發明的目的是提供一種lnc-HR1、用途及其克隆方法，實現從源頭抑制肝臟內脂類的合成。為了解決上述技術問題，本發明提供的一種lnc-HR1、用途及其克隆方法是這樣實現的：一種長鏈非編碼RNAlnc-HR1，具有如下序列：GGTGATAAGGGTCATCTCTATGAATAGCTTTCTTCCTGGAACTGACTGGACTTCACAACCAATTTTGGGCTAGTGTGGAGAGATCAGCTGTGAGAAACATCCATTGATTTGCTCAGGCTGCCCTTTGTATCTTAATGCTTCAGGTTTTGTTATCCTGCGCCTTTCTTCTGTCTTCTTTCCTCATAAGTTTTTTAGATACAATTTTATTGCCAATAATTAAAGAGTGAGAATGAGCGGCAATGGGCTGGTATGGTTGCATTCAAACTCCAAAGTTCACATTTTGGAATATTGATTTTTGCTTGAGAACAACTTACCTAAAAACCATGGGAATTTGGCAGGGAGGGATGTGATGGGGCATATGTTGAGTTCTTTCAAGGAATTTAACTTTCATTTCTGAAGAAGTAAAAACTGTGGCATGGT。所述lnc-HR1的克隆方法，包括：提取細胞的總RNA，在所述總RAN中加入逆轉錄酶，所述總RAN逆轉錄成cDNA，以所述cDNA為PCR反應模板克隆得到所述lnc-HR1。可選的，所述PCR反應的引物為：上游序列：5’-GGAGAATAGCTTTCTTCCTGGAACT-3’下游序列：5’-CCGCATGCCACAGTTTTTACTTCTTC-3’。所述lnc-HR1抑制肝臟中脂類合成的用途。可選的，所述lnc-HR1抑制肝臟中甘油三酯合成的用途。可選的，所述的lnc-HR1抑制SREBP-1c合成的用途，所述固醇調節元件結合蛋白1c促進所述甘油三酯的合成。可選的，所述的lnc-HR1抑制所述SREBP-1cmRNA轉錄的用途。所述的lnc-HR1在抑制肝臟中脂類合成的藥物中的用途。可選的，lnc-HR1在抑制肝臟中甘油三酯合成的藥物中的用途。可選的，lnc-HR1在抑制肝臟中SREBP-1c合成的藥物中的用途。本發明從Huh7細胞中提取總RNA、克隆lnc-HR1，構建lnc-HR1的真核表達載體（pMIR-lncHR1），然后將lnc-HR1的真核表達載體轉染到Huh7細胞中，經過一段時間的培養，實時熒光定量PCR檢測細胞中lnc-HR1、固醇調節元件結合蛋白（SREBP-1c）的mRNA；使用2-△△Ct法分析mRNA轉錄水平的變化，結果如下：lncHR1的表達量隨著pMIR-lncHR1劑量的增加而梯度升高，SREBP-1c的mRNA表達水平受到lncHR1的抑制，并且呈劑量依賴性，最終受抑制率達到50%左右。將轉染了pMIR-lncHR1的Huh7細胞裂解，進一步驗證在蛋白質水平上lncHR1對SREBP-1c的抑制作用，westernblot結果顯示：隨著lncHR1劑量的增加，SREBP-1c的蛋白表達受到抑制。本發明提供的lnc-HR1能夠抑制SREBP-1c的合成，而SREBP-1c是甘油三酯合成的關鍵因子，從而抑制甘油三酯的合成，實現從源頭抑制肝臟內脂類的合成，有效的降低脂類的含量和保護肝臟。附圖說明圖1是本發明提供的lnc-HR1復制電泳圖；圖2是本發明構建的真核表達載體pMIR-DFT圖譜；圖3是本發明提供的pMIR-lncHR1劑量與lncHR1表達關系圖；圖4是本發明提供的lncHR1劑量與SREBP-1c的mRNA表達關系圖；圖5是本發明提供的lncHR1劑量與SREBP-1c的關系圖；圖6是本發明提供的經油酸處理的細胞試驗結果對比圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明從細胞中提取總RNA并克隆lncHR1，然后構建質粒表達載體pMIR-lncHR1，然后將pMIR-lncHR1轉染到細胞中培養，實時熒光定量PCR確定SREBP-1c的mRNA表達水平受到lncHR1的抑制，SREBP-1c的蛋白表達受到抑制；然后油酸處理細胞，設置正常細胞組、轉染了pMIR-lncHR1和轉染pMIR-DFT空載體質粒細胞組對比試驗，得出轉染了pMIR-lncHR1的細胞，甘油三酯的積累形式（脂滴）累積受到抑制。1、提取總RNA并克隆lncHR1。按照Trizol方法，Thermo公司生產的TRIzol試劑提取Huh7細胞的總RNA，在總RAN中加入逆轉錄酶，逆轉錄成cDNA，在同一反應體系中以cDNA為模板，使用TAKARA公司生產的一步法RT-PCR試劑盒，，按照說明書操作方法克隆lncHR1基因，克隆引物如表1所示；PCR的反應體系和循環條件如表2所示。使用ThermoPCR儀進行的PCR反應。引物序列上游5’-GGAGAATAGCTTTCTTCCTGGAACT-3’下游5’-CCGCATGCCACAGTTTTTACTTCTTC-3’注：斜體（GGA,CCG）為單酶切位點的保護堿基表1表2獲得的PCR產物，采用常規的1%瓊脂糖核酸電泳上樣量5μl，使用bio-Rad核酸電泳儀，結果如圖1所示：lncHR1RNA大小為420bp，通過測序得到lncHR1RNA序列為：GGTGATAAGGGTCATCTCTATGAATAGCTTTCTTCCTGGAACTGACTGGACTTCACAACCAATTTTGGGCTAGTGTGGAGAGATCAGCTGTGAGAAACATCCATTGATTTGCTCAGGCTGCCCTTTGTATCTTAATGCTTCAGGTTTTGTTATCCTGCGCCTTTCTTCTGTCTTCTTTCCTCATAAGTTTTTTAGATACAATTTTATTGCCAATAATTAAAGAGTGAGAATGAGCGGCAATGGGCTGGTATGGTTGCATTCAAACTCCAAAGTTCACATTTTGGAATATTGATTTTTGCTTGAGAACAACTTACCTAAAAACCATGGGAATTTGGCAGGGAGGGATGTGATGGGGCATATGTTGAGTTCTTTCAAGGAATTTAACTTTCATTTCTGAAGAAGTAAAAACTGTGGCATGGT。2、構建真核表達載體pMIR-lncHR1首先：克隆基因lncHR1的消化和真核表達載體pMIR-DFT的線性化真核表達載體pMIR-DFT圖譜如圖2所示，lncHR1在表達載體上的單克隆位點為BglⅡ（A^GATCT）和XhoⅠ（C^TCGAG）。將lncHR1克隆產物消化、獲得兩個酶切位點的黏性末端，對表達載體進行線性化；線性化雙切酶體系如表3所示。表3然后2%瓊脂糖核酸電泳，切割下lncHR1消化產物片段和質粒線性化片段，用QUIGENDNA膠回收試劑盒，按照KIT的操作步驟獲得lncHR1線性化片段和線性化質粒DNA。然后，將線性化質粒和消化回收的lncHR1片段連接使用NEB公司生產的T4DNAligase，將線性化質粒和消化回收的lncHR1片段連接，T4連接酶反應體系如表4所示：表4取5μlT4連接產物，用DH5α感受態細胞做常規的轉化實驗，培養12h挑取單菌落測序，測序引物為MSCV序列：GGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAAT，以確定lncHR1已經連接到過表達質粒的克隆位點；陽性克隆擴大培養、提取質粒，做后續實驗。此時，提取的質粒中已經含有lncHR1基因。3、細胞轉染在24wellplate的Huh7細胞中轉染過表達質粒pMIR-lncHR1，以空載體質粒pMIR-DFT為對照。轉染具體操作如下：轉染試劑使用SignaGen生產的LipoD293；Gibco生產的FBS、DMEM培養基和雙抗抗生素。1）轉染前24h，用含10%FBS的DMEM培養基在24孔板內接種培養細胞，37℃，恒溫、5%CO2培養箱培養過夜。2）待細胞長到80％匯合度，轉染前1h更換新鮮的完全培基。3）用空DMEM培養基稀釋1μgDNA質粒，混勻。4）用空DMEM培養基稀釋2μl轉染試劑D293，混勻。5）將轉染試劑逐滴加入到稀釋的質粒中，輕柔混勻，室溫靜置溫育15min。6）將步聚5）中質粒和轉染試劑的混懸液均勻滴加入待轉染的細胞中；輕輕晃動，以使其分布均勻。7）5～8h換成新的含10%FBS的培養基，繼續培養48h，得到轉染過表達質粒pMIR-lncHR1的細胞。4、在mRNA水平驗證lncHR1對SREBP-1c的抑制作用收集過表達質粒pMIR-lncHR1的細胞于Trizol試劑中，提取RNA，以總RNA為模版，對lncHR1以及SREBP-1c和β-actin的mRNA水平進行相對定量測定，進行qRT-PCR實驗；使用TAKARA的OneStepSYBRPrimescriptRT-PCRKIT。.定量引物如下：結果如表5下：表5PCR反應體系及循環條件如表6所示：表6相對定量中以管家基因β-actin為內參，用2-△△Ct法分析mRNA轉錄水平的變化。結果如圖3和圖4所示：lncHR1的表達量隨著pMIR-lncHR1劑量的增加而梯度升高，SREBP-1c的mRNA表達水平受到lncHR1的抑制，并且呈劑量依賴性，最終受抑制率達到50%左右。結果表明，SREBP-1c在轉錄水平上受到過表達lncHR1的抑制作用。5、在蛋白質水平上驗證lncHR1對SREBP-1c的抑制作用收集過表達質粒pMIR-lncHR1的細胞，用2×loadingbuffer裂解液裂解，用于蛋白質檢測實驗SREBP-1c抗體（SCRUZ）；Sigma的抗鼠β-actin。,如圖5所示，westernblot結果顯示：隨著lncHR1劑量的增加，SREBP-1c的蛋白表達受到抑制，呈現出劑量的梯度依賴性。6、pMIR-HR1抑制肝細胞中甘油三酯合成脂滴（LDs，LipidDroplets）是肝病發生時，肝細胞中重要的脂類累積形式，主要有中性脂類甘油三酯（Triglyceride，TG）組成。首先用0.5μM的油酸（OA，OleicAcid）處理Huh7細胞，誘導細胞形成脂肪變性細胞；采用油紅染色的方法，觀察細胞內LDs的累積。在脂肪變性細胞中，采用3中轉染方式轉染pMIR-HR1，48h后用油紅染色，如圖6所示，藍色的（黑白圖中顯示為大塊黑色）為細胞核，紅色的（黑白圖中顯示為小黑點）為LDs；圖6中A為未經油酸處理的細胞，含有少量的LDs；B為經油酸處理脂肪變性的細胞，轉染pMIR-DFT空載體質粒，含有大量的LDs；C為油酸處理脂肪變性的細胞，轉染了pMIR-HR1，LDs量明顯減少。結果表示，過表達lncHR1后，LDs的累積受到抑制。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>新鄉醫學院<120>一種長鏈非編碼RNAlnc-HR1用途及克隆方法<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>420<212>RNA<213>人種（Humansp.）<400>1ggtgataagggtcatctctatgaatagctttcttcctggaactgactggacttcacaacc60aattttgggctagtgtggagagatcagctgtgagaaacatccattgatttgctcaggctg120ccctttgtatcttaatgcttcaggttttgttatcctgcgcctttcttctgtcttctttcc180tcataagttttttagatacaattttattgccaataattaaagagtgagaatgagcggcaa240tgggctggtatggttgcattcaaactccaaagttcacattttggaatattgatttttgct300tgagaacaacttacctaaaaaccatgggaatttggcagggagggatgtgatggggcatat360gttgagttctttcaaggaatttaactttcatttctgaagaagtaaaaactgtggcatggt420當前第1頁1 2 3