本發明屬于酶處理
技術領域：
，具體涉及一種增強中性蛋白酶穩定性的方法。
背景技術：
：中性蛋白酶是最早為人類所發現并應用于工業化生產的蛋白酶制劑之一，中性蛋白酶在焙烤行業、大豆分離蛋白、酵母抽提物、啤酒、紡織工業、皮革工業、飼料工業、醫藥等均有廣泛應用。國內現有的中性蛋白酶主要是粉末制劑，但是粉末制劑菌落不好控制，并且使用時需要溶解，還會有殘渣，對于一些衛生級別較高的，很難達到衛生標準。由于中性蛋白酶是一種活性物質，又是一種蛋白酶，自身就可以分解自身，酶活力下降很快。室溫條件下一周酶活力會損失50％。因此，需要針對上述的中性蛋白酶不穩定性的特點，設計一種能增強保存中的中性蛋白酶穩定性的方法。技術實現要素：為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種能增強中性蛋白酶穩定性的方法。本發明提供的一種保存液體中性蛋白酶的穩定劑，可以在液體條件下較長時間保存中性蛋白酶的酶活力。本實驗的技術方案是：本實驗保存液體中性蛋白酶的穩定劑由氯化鈣、山梨酸鉀、山梨糖醇混配攪拌制成。選用山梨糖醇可以使中性蛋白酶分子在水溶液中保持其穩定性，不易變性失去活性；選用山梨酸鉀控制菌落數，便于滿足食品條件的要求；選用氯化鈣可以激活中性蛋白酶活性，提高酶活力。此穩定劑可以使液體中性蛋白酶≤25℃的條件下儲存4個月保持中性蛋白酶活力90％，形成穩定的產品工藝配方，便于在食品、皮革、紡織等方面的應用。增強保存中的中性蛋白酶穩定性的方法，該方法是在中性蛋白酶中加入穩定劑。上述的穩定劑包括防腐劑、吸水劑、糖類中的至少一種。上述的中性蛋白酶為液體中性蛋白酶。上述的防腐劑為山梨酸鉀、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸鈉、丙酸鈣、對羥基苯甲酸乙酯中的任一種；上述的吸水劑為無水氯化鈣；上述的糖類為葡萄糖、麥芽糖、果糖、葡聚糖、木糖醇、赤蘚醇、低聚果糖、異構乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇中的任一種。優選的，上述的穩定劑包括吸水劑和糖類，所述的吸水劑為無水氯化鈣，無水氯化鈣的加入量為中性蛋白酶質量的0.07-0.13％；所述的糖類為山梨糖醇，所述的山梨糖醇的添加量為液體中性蛋白酶質量的40-80％。更優選的，上述的穩定劑包括無水氯化鈣、山梨糖醇、山梨酸鉀和葡萄糖，無水氯化鈣的加入量為中性蛋白酶質量的0.07-0.13％；山梨糖醇的添加量為液體中性蛋白酶質量的40-80％；山梨酸鉀的重量為中性蛋白酶質量的0.12-0.3％，所述葡萄糖的重量為中性蛋白酶質量的0.05-0.2％。更優選的，上述的穩定劑包括吸水劑和糖類；吸水劑為無水氯化鈣，無水氯化鈣的加入量為中性蛋白酶質量的0.07-0.13％；糖類為山梨糖醇、蔗糖和海藻糖，所述的山梨糖醇的添加量為液體中性蛋白酶質量的40-80％；蔗糖添加量為為液體中性蛋白酶質量的10％-25％，海藻糖添加量為為液體中性蛋白酶質量的2％-5％。上述的穩定劑包括無水氯化鈣、山梨糖醇、山梨酸鉀、葡萄糖、蔗糖和海藻糖；無水氯化鈣的加入量為中性蛋白酶質量的0.07-0.13％；山梨糖醇的添加量為液體中性蛋白酶質量的40-80％；山梨酸鉀的重量為中性蛋白酶質量的0.12-0.3％；葡萄糖的重量為中性蛋白酶質量的0.05-0.2％；蔗糖添加量為為液體中性蛋白酶質量的10％-25％；海藻糖添加量為為液體中性蛋白酶質量的2％-5％。8.如權利要求1所述的增強保存中的中性蛋白酶穩定性的方法，包括下述的步驟：取中性蛋白酶濃縮液，邊攪拌邊加入無水氯化鈣和山梨酸鉀，所述的無水氯化鈣的加入量為中性蛋白酶質量的0.07-0.13％，山梨酸鉀的重量為中性蛋白酶質量的0.12-0.3％，攪拌至溶解后加入山梨糖醇，所述的山梨糖醇的添加量為液體中性蛋白酶質量的40-80％，繼續攪拌至物料充分混勻。將充分混勻后的中性蛋白酶混合物料中加入pH調節劑，調節pH至5.00-6.00；所述的pH調節劑為冰乙酸、檸檬酸中的任一種；將經過pH調節后的中性蛋白酶混合物料置于0-25℃下存放。本發明的有益效果在于，采用本發明的方法能顯著的增強中性蛋白酶的穩定性，本發明的方法是在中性蛋白酶中加入穩定劑無水氯化鈣、山梨酸鉀、山梨糖醇，以增強其穩定性，進一步的，調節上述的加入了穩定劑的中性蛋白酶的pH，然后將上述的中性蛋白酶混合物料置于25℃以下的環境中保存，中性蛋白酶的酶活殘留率為90％以上。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但并不因此限制本發明。實施例1取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2g無水氯化鈣，加山梨酸鉀4g，攪拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，繼續攪拌10min。用冰乙酸按照下表調pH,檢測酶活力。再將各組樣分為三組，一組室溫放置(溫度15-30℃，以下涉及室溫均同)，一組25℃靜置，另一組37℃水浴恒溫振蕩。酶活力檢測方法參照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的測定福林法，以下測酶活如無特殊說明，均采用此方法。液體中性蛋白酶各組pH及酶活(16.2.27)名稱乙酸調pH酶活力06.454022116.442719626.012685335.512719645.0626902三種不同條件下放置4酶活及pH檢測結果2016.2-2016.4室溫約為15-20℃；2016.5-2016.6室溫約為20-30℃。整個實驗過程中各實驗組外觀均澄清透亮，無異味。由表2數據可以看儲存出溫度對液體中性蛋白酶影響較大。儲存溫度越高，酶活下降越快。25℃下放置4個月，酶活損失約10％。且pH為5.00-5.50時在各儲存條件下酶活殘留相對較高。結合液體中性蛋白酶本身的特殊性，儲存溫度應小于25℃。本發明的液體中性蛋白酶，各原料的重量占液體中性蛋白酶質量的百分比為：山梨糖醇50％，山梨酸鉀0.2％，無水氯化鈣0.1％，用冰乙酸-乙酸鈉調酶液pH控制在5.00-6.00，儲存溫度≤25℃，酶活殘留率為90％以上。對比例1取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2g無水氯化鈣，加山梨酸鉀4g，繼續攪拌10min。用冰乙酸按照下表調pH,在25℃的條件下靜置，檢測酶活力。名稱乙酸調pH酶活力16.454022126.014036335.514055545.024067925℃條件下靜置一段時間后測得其酶活結果如下：由上述表格可以看出未添加山梨糖醇各組酶活均快速下降，25℃放置一個月酶活下降約40％。對比例2取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加山梨酸鉀4g，攪拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，繼續攪拌10min。名稱乙酸調pH酶活力16.442599626.012555335.512549645.062590225℃的條件下儲存，檢測結果如下表：對比例3取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2g無水氯化鈣，攪拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，繼續攪拌10min。檢測結果如下表：25℃的條件下放置1個月，各組外觀均變混濁，有異味，鏡檢結果有雜菌。實施例2驗證實驗山梨糖醇添加量對液體中性蛋白酶儲存穩定性的影響將液體中性蛋白酶添加0.2％的山梨酸鉀，用冰乙酸-乙酸鈉調pH為5.00，將酶液按照下表添加山梨糖醇，分別攪拌均勻，置于室溫條件下，跟蹤檢測酶活變化,酶活力單位u/g。試驗分組編號液體中性蛋白酶,g山梨糖醇，g11000210040310060410080兩周后檢測各組酶活力及pH，檢測結果如下表：不同山梨糖醇添加量中性蛋白酶酶活及pH變化由上述表格可以看出山梨糖醇添加量對液體中性蛋白酶酶活力影響較大。室溫放置1個月，1#酶活損失約50％，添加山梨糖醇的其他組酶活變化不明顯；室溫繼續放置三個月，1#酶活殘留僅17％，其他組山梨糖醇添加量越高，酶活殘留越高，山梨糖醇添加量高于40％時酶活殘留率高于90％，添加量為80％時酶活殘留率達到100％。實施例3取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加1.4g無水氯化鈣，加山梨酸鉀2.4g，攪拌至溶解后加入山梨糖醇800g，繼續攪拌10min。用冰乙酸調pH為5.12,檢測酶活力。再將各組樣分為三組，一組室溫放置(15℃-30℃)，一組25℃靜置，另一組15℃冷藏。酶活力檢測方法參照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的測定福林法，以下測酶活如無特殊說明，均采用此方法。三種不同條件下放置酶活及pH檢測結果由表格可以看出，按液體中性蛋白酶質量比添加0.07％的無水氯化鈣、0.2％的山梨酸鉀及50％的山梨糖醇在25℃的條件下放置120d，酶活殘留約為94％。實施例4取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2.6g無水氯化鈣，加山梨酸鉀6g，攪拌至溶解后加入山梨糖醇1600g，繼續攪拌10min。用冰乙酸調pH為5.15,檢測酶活力。再將各組樣分為三組，一組室溫放置(15℃-30℃)，一組25℃靜置，另一組15℃恒溫冷藏。酶活力檢測方法參照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的測定福林法，以下測酶活如無特殊說明，均采用此方法。液體中性蛋白酶各組pH及酶活三種不同條件下放置酶活及pH檢測結果實施例5取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2g無水氯化鈣，加山梨酸鉀4g，攪拌至溶解后加入蔗糖300g，加入海藻糖60g，繼續攪拌10min。用冰乙酸調pH為5.11,檢測酶活力。再將各組樣分為三組，一組室溫放置(15℃-30℃)，一組25℃靜置，另一組15℃恒溫冷藏。酶活力檢測方法參照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的測定福林法，以下測酶活如無特殊說明，均采用此方法。三種不同條件下放置酶活及pH檢測結果實施例6取中性蛋白酶濃縮液2000g(檢測pH為6.45)，邊攪拌邊加2g無水氯化鈣，加山梨酸鉀4g，攪拌至溶解后加入蔗糖300g，加入海藻糖60g、山梨糖醇900g，葡萄糖100g，繼續攪拌10min。用冰乙酸調pH為5.11,檢測酶活力。再將各組樣分為三組，一組室溫放置(15℃-30℃)，一組25℃靜置，另一組15℃恒溫冷藏。酶活力檢測方法參照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的測定福林法，以下測酶活如無特殊說明，均采用此方法。三種不同條件下放置酶活及pH檢測結果當前第1頁1 2 3