豬源BVDV?2毒株感染性cDNA克隆的構建方法及應用與流程

本發明屬于獸用生物制品技術領域。具體涉及一種豬源BVDV-2毒株感染性cDNA克隆的構建方法及應用。

背景技術：

BVDV的宿主譜非常廣，除了能感染牛，還可引起豬、羊、鹿、駱駝和多種野生動物發病。但直到2012年，世界動物衛生組織(OIE)才將該病列為必須通報的疾病之一。

豬感染BVDV不表現出臨床癥狀，或出現類似于豬瘟的癥狀，因而不僅給豬瘟的預防和控制帶來了很大的困難，也使BVDV的防控難上加難。目前，國內豬群中BVDV的感染現狀較為嚴重，已成為一個不容忽視的問題。衛秀余等在2005～2009年間，對國內20多個省市300多個規模化養豬場進行了BVDV的流行病學調查，發現各年度的BVDV陽性率分別為22.2％、43.1％、46.4％、66.7％和80.8％，呈逐年擴增的趨勢且勢態嚴重。鄧宇等利用套式RT-PCR在2007～2010年對國內部分地區的臨床樣品進行篩查，檢出BVDV的陽性率分別為23.1％(2007年)、27.7％(2008年)、33.6％(2009年)和23.6％(2010年)。梁晟等對2010～2012年廣西部分地區豬病進行調查，結果表明BVDV的檢出率為26.92％。

BVDV和CSFV、BDV存在廣泛的交叉感染，因此，不僅給BVDV的診斷和防制帶來了困難，而且也混淆了CSFV和BDV的檢疫。目前，國外對BVDV的防控主要采用疫苗注射，加強監測，淘汰免疫耐受及持續感染的動物。而在國內，BVDV感染主要以持續感染和免疫耐受等隱性感染為主，因此BVDV的防控應著重在于排除這種隱性感染動物。

反向遺傳學技術最具潛力的應用在于新型疫苗株的研制，通過在cDNA水平對基因組進行修飾，可以開發出高效而安全的標記疫苗。此外，利用這一技術還可在病毒基因組中插入外源基因序列，從而使RNA病毒成為疫苗和基因治療的載體。因此，該技術也為我們深入研究牛源BVDV和豬源BVDV的感染機制及防控提供了有效技術平臺。

目前，國內對BVDV的研究相對滯后，一方面由于人們對該病的重視度不夠，另一方面由于深入研究該病毒的技術平臺太少。而感染性克隆的成功構建給我們提供了一個便利而有效的工具，讓我們可以從分子水平對病毒基因組加以修飾和分析，從而進一步深入了解其基因功能及疾病機制。雖然，目前已成功構建多株BVDV分離株的感染性克隆，但這些都是針對牛源BVDV分離株的，至今為止還沒有豬源BVDV-2感染性克隆的構建。因此，本研究首次構建了豬源BVDV-2分離株SH-28的感染性克隆，為后續豬源BVDV的相關研究建立了一個平臺。

技術實現要素：

本發明的首要目的是提供一種豬源BVDV-2感染性cDNA，為后續體外修飾RNA、豬源BVDV-2感染機制、不同動物源和基因型BVDV的蛋白功能差異研究提供一個有效的技術平臺。

本發明所述的豬源BVDV-2感染性cDNA，包含了豬源BVDV-2種毒全長、在該cDNA 5’末端插入T7RNA聚合酶啟動子、在cDNA 3’末端插入SbfI限制性內切酶。

本發明還公開了包含豬源BVDV-2毒株感染性cDNA克隆及在該基因組cDNA的5’末端插入T7RNA聚合酶I啟動子序列，在3’末端插入SbfI限制性內切酶的質粒pASH28及其構建。

所述的pASH28的構建方法是：提取豬源BVDV-2分離株SH-28的總RNA，以SEQ ID No.1-18為引物通過RT-PCR方法擴增其基因組的9個cDNA片段：SHA、SHB、SHC、SHD、SHE、SHF、SHG、SHH、SHI，所述9個片段分別克隆至pMD 19T Simple載體中得到pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E、pMD-F、pMD-G、pMD-H和pMD-I；

將pMD-D(SphI+BglI)、pMD-E(BglI+EcoRV)和pBR322(SphI+EcoRV)進行三片段連接，獲得pBR-DE；然后將pMD-C(PshAI+SphI)連入pBR-DE(PshAI+SphI)，獲得pBR-CDE；同時將pMD-A(EagI+SphI)、pMD-B(SphI+PshAI)和pBR322(EagI+PshAI)進行三片段連接，獲得pBR-AB；最后將pBR-AB(EagI+PshAI)連入pBR-CDE(EagI+PshAI)，構建5’大片段pBR-AE；

然后將pMD-F(EcoRV+SacI)和pMD-G(SacI+XbaI)連入pACYC184(EcoRV+XbaI)，構建pAC-FG；同時將pMD-H(XbaI+NheI)和pMD-I(NheI+ClaI)共同連入pACYC184(XbaI+ClaI)，獲得pAC-HI；將pAC-FG(EcoRV+XbaI)與pAC-HI(EcoRV+XbaI)相互連接，獲得3’大片段pAC-FI；

最終將pBR-AE(EagI+EcoRV)和pAC-FI(EagI+EcoRV)相互連接，獲得全長cDNA感染性克隆質粒pASH28。

為保證病毒全長感染性克隆的穩定性，我們選用低拷貝載體pACYC184來進行構建，并利用PCR技術在SH-28基因組的5’末端和3’末端分別引入T7啟動子序列和一個單一的SbfI酶切位點。基于全長轉錄本5’端和3’端的改變對感染性有一定的影響，在設計時將T7啟動子序列精確置于5’端；此外，SbfI酶切位點的序列為CCTGCA/GG，與SH-28基因組3’末端具有共同的“C”，一方面減少了冗余堿基的引入，另一方面使質粒線性化，轉錄到3’端能夠正確終止。為保證病毒基因組的準確性，反轉錄和PCR過程中分別選用SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)和Expand long template PCR system(Roche)。但該全長cDNA感染性克隆pASH28在基因組3978bp處存在一個核苷酸突變，經多次克隆和測序的結果都是一致的。該位點的突變導致了一個新的酶切位點AseI的出現，我們沒有糾正該突變，而是將其作為區分拯救病毒和父本病毒的一個遺傳標記。經間接免疫熒光檢測和RT-PCR鑒定，發現隨著傳代次數的增加，拯救病毒vASH的病毒滴度逐漸增加，且到第5代以后達到穩定狀態。在不斷的傳代過程中拯救病毒基因組中沒有丟失AseI酶切位點，說明其遺傳特性穩定。以上數據證實我們以豬源BVDV-2分離株SH-28為模板，成功建立了SH-28的全長cDNA感染性克隆平臺。

在本研究中，為了提高拯救病毒的病毒滴度，我們選用帶毒傳代的方法進行拯救病毒的培養。但間接免疫熒光鑒定結果顯示，感染第1代vASH的細胞孔中只有少量的綠色熒光，而感染第3代vASH的細胞孔中的綠色熒光也才達到一半，說明病毒增殖效果不是很理想，雖然vASH傳到第5代以后，其病毒滴度達到了穩定，且vASH的病毒滴度增長趨勢也和親本病毒的病毒滴度增長趨勢相一致。我們推測可能是因為在24孔細胞板中進行病毒傳代導致的，由于24孔細胞板的孔面積較小，而每次傳代時孔內細胞鋪的數量太多，導致細胞在短時間內即長成單層，生長受到限制，從而使得病毒不能在細胞內很好的增殖。因此，在病毒拯救過程中，選擇正確的病毒傳代方法也很重要。

該質粒線性化后，體外轉錄成RNA，并轉染MDBK細胞，能成功拯救出牛病毒性腹瀉病毒。這種豬源BVDV-2感染性cDNA克隆可用于研究不同動物源BVDV蛋白之間的功能差異，也可用于遺傳改造制備高效價減毒BVDV疫苗。

綜上所述，本發明成功建立了豬源BVDV-2分離株SH-28的感染性克隆平臺，不僅為后續豬源BVDV的基因功能研究奠定了基礎，也為豬源BVDV和牛源BVDV之間的基因功能差異等研究提供了技術平臺。

附圖說明

圖1.SH-28株基因組中酶切位點的分布圖

圖2.SH-28株全長cDNA克隆的整體連接策略

圖3.SH-28分離株各cDNA片段的PCR擴增結果

圖4.各cDNA重組質粒提質粒鑒定結果

圖5.各cDNA重組質粒酶切鑒定結果

圖6.全基因組cDNA克隆質粒pASH28的酶切鑒定

圖7.拯救病毒vASH的間接免疫熒光檢測

圖8.不同代次拯救病毒vASH的RT-PCR檢測

圖9.RT-PCR檢測拯救病毒vASH的特異性片段

圖10.拯救病毒和親本病毒的病毒滴度增長趨勢比較

具體實施方式

1.材料

1.1病毒、細胞、菌體和載體

豬源BVDV-2毒株SH-28由本實驗分離并鑒定[陶潔,等.豬源牛病毒性腹瀉病毒SH-28分離株的全基因組序列及遺傳化分析.中國獸醫學報,2013,33(3):321-325.]。基因工程菌E.Coli HB101和中拷貝克隆載體pBR322購自TAKARA公司，低拷貝克隆載體pACYC184購自NEB公司。MDBK細胞系由美國賓夕法尼亞大學Bello教授惠贈。

1.2試劑與抗體

DNA Ligation Kit LONG和pMD 19T Simple載體購自TaKaRa公司；各種限制性核酸內切酶購自NEB公司；Expand long template PCR system購自Roche公司；胰酶、DMEM培養基和Opti-MEM培養基購自Gibco公司；QIAprep○R Spin Miniprep Kit購自QIAGEN公司；MEGAscript T7購自Ambion公司；脂質體Lipofectamine LTX and Plus^TM Reagent和SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR購自Invitrogen公司；MAb Bz-53(BVDV-2)和D89(BVDV-1)由美國賓夕法尼亞大學Bello教授惠贈；HRP標記羊抗鼠IgG、FITC標記羊抗鼠IgG購自博士德公司；其它常規試劑均為國產分析純級產品。

1.3主要儀器

2720Thermal Cycler PCR儀(Applied Biosystems)，數碼凝膠成像分析系統JD-801(捷達公司)，DYY-604型穩壓穩流電泳儀(南京新校園生物技術研究所)，移液槍(Eppendorf)，微量臺式離心機(Thermol)，二氧化碳培養箱(Thermol)，恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，MP120-2電子秤(上海肯強儀器有限公司)，超低溫冰箱(Haier)，IMT2熒光顯微鏡(Olympus)。

2.方法

2.1 SH-28株全長cDNA感染性克隆的構建

2.1.1各cDNA片段的PCR擴增及克隆

提取豬源BVDV-2分離株SH-28的總RNA，通過RT-PCR方法擴增其基因組的9個cDNA片段，分別為SHA、SHB、SHC、SHD、SHE、SHF、SHG、SHH、SHI，擴增各片段的引物見表1。為了保證擴增產物與原序列的忠實性，選用高保真性、高活性的SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR進行反轉錄，PCR反應時也選用高保真性的Roche Expand long template PCR system。

回收純化各PCR擴增片段，利用“TA”克隆法將各片段分別克隆至pMD 19T Simple載體中，連接產物轉化HB101感受態細胞，通過載體上的氨芐抗性標記篩選各cDNA片段的陽性重組子pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E、pMD-F、pMD-G、pMD-H和pMD-I。

表1.SH-28感染性克隆各片段引物

2.1.2 cDNA陽性克隆的篩選與鑒定

在上述轉化的氨芐抗性平板上挑取單個菌落接種于氨芐抗性的LB液體中，37℃振蕩培養16h；然后用堿裂解法提取質粒，并用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。繼而進一步用相應的限制性內切酶進行雙酶切鑒定，最后將篩選出的各cDNA陽性克隆送上海生物工程技術有限公司進行測序，每個樣重復測序3次。

2.1.3全長cDNA的連接和克隆

由于BVDV全基因組長約12.3kb，其中包含的單一限制性酶切位點一般都不是常用的限制性內切酶，因此我們選擇將全基因組cDNA分成2個大片段連接的策略。以全基因組中間位置的單一酶切位點EcoRV為分界，分成5’大片段和3’大片段，從而避免了常用酶切位點之間的相互干擾(圖1)，整體連接策略如圖2所示。

考慮到各cDNA片段和載體上酶切位點單一性和順序的問題，將5’大片段連入pBR322載體中，而3’大片段則連入pACYC184載體中，最終將兩個大片段相連，一起克隆到pACYC184載體中，完成全長cDNA感染性克隆的連接。5’大片段的具體連接步驟為：首先將pMD-D(SphI+BglI)、pMD-E(BglI+EcoRV)和pBR322(SphI+EcoRV)進行三片段連接，獲得pBR-DE；然后將pMD-C(PshAI+SphI)連入pBR-DE(PshAI+SphI)，獲得pBR-CDE；同時將pMD-A(EagI+SphI)、pMD-B(SphI+PshAI)和pBR322(EagI+PshAI)進行三片段連接，獲得pBR-AB；最后將pBR-AB(EagI+PshAI)連入pBR-CDE(EagI+PshAI)，構建5’大片段pBR-AE。

3’大片斷的具體連接步驟為：首先將pMD-F(EcoRV+SacI)和pMD-G(SacI+XbaI)連入pACYC184(EcoRV+XbaI)，構建pAC-FG；同時將pMD-H(XbaI+NheI)和pMD-I(NheI+ClaI)共同連入pACYC184(XbaI+ClaI)，獲得pAC-HI；最后將pAC-FG(EcoRV+XbaI)與pAC-HI(EcoRV+XbaI)相互連接，獲得3’大片段pAC-FI。

最后進行兩個大片段的連接，將pBR-AE(EagI+EcoRV)和pAC-FI(EagI+EcoRV)相互連接，獲得全長cDNA感染性克隆質粒pASH28。以上酶切、回收、連接等均屬于常規操作，按照《分子克隆實驗指南》進行操作。

2.1.4全長cDNA感染性克隆質粒的鑒定

按照Spin Miniprep Kit說明書抽提全長cDNA感染性克隆質粒pASH28，具體操作步驟為：取4mL菌液，12,000g離心2min收集菌體，去盡殘夜；加250μL Buffer P1，重懸菌體；加250μL Buffer P2，輕輕顛倒4～6次；加350μL Buffer N3，同樣輕輕顛倒4～6次，室溫放置5min；4℃，12,000g離心10min，小心吸取上清，置于QIAprep吸附柱中，室溫靜置2min，然后12,000g離心30s；將收集管中的液體重新吸置QIAprep吸附柱中，重復上述操作1次；然后加750μL Buffer PE洗1次，12,000g離心30s；棄去收集管中液體，12,000g離心1min，棄盡殘液；然后將QIAprep吸附柱置于一新的1.5mL指形管上，37℃干燥5min；加30μL超純水于吸附柱中，室溫靜置2min；12,000g離心30s，離心所得液體即為提純的pASH28質粒。

采用PCR擴增和限制性內切酶酶切的方法，對全長cDNA克隆質粒pASH28進行雙重鑒定。PCR鑒定選用其中4對cDNA擴增引物(SHC～SHF)；為了進一步鑒定全長cDNA克隆質粒的準確性，選用三組限制性內切酶進行酶切鑒定，第一組選用EcoRV和PshAI雙酶切，第二組用XhoI和XbaI雙酶切，第三組為SacI單酶切。酶切體系為1μL質粒、0.3μL限制性內切酶、XμL Buffer，補水至20μL(X：不同的限制性內切酶相對應不同的Buffer)，37℃水浴1h，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果。

2.2體外轉錄

首先用SbfI限制性內切酶單酶切感染性克隆質粒，使之線性化；然后終止酶切反應，即在上述酶切體系中加入1/20體積0.5M EDTA、1/10體積3M NaAc和2倍體積無水乙醇并置-20℃沉淀30min；13,000g離心15min，棄上清，干燥沉淀，然后用適量超純水溶解沉淀，至終濃度為0.5～1μg/μL。為了消除提質粒和酶切過程中可能產生或引進的RNase或其他轉錄抑制劑，進行以下處理：加入終濃度為100～200μg/mL蛋白酶K和0.5％SDS，50℃水浴30min，然后用酚/氯仿抽提、酒精沉淀的方法純化產物，最后用8μL RNase-free H₂O溶解沉淀。

按照MEGAscript T7試劑盒說明書，將經上述處理的線性化質粒進行體外轉錄，具體反應體系為：8μL線性化的感染性克隆質粒，ATP、CTP、GTP、UTP各2μL，2μL 10×Reaction Buffer，2μL Enzyme Mix，充分混勻后，37℃孵育4h；加入1μL TURBO DNase，37℃作用15min；然后加入30μL RNase-free H₂O和30μL LiCl，-20℃沉淀30min以上；4℃13,000g離心15min；棄上清，70％乙醇洗一遍；干燥，最后用20μL RNase-free H₂O溶解沉淀備用。

2.3細胞轉染

轉染前24h，取生長狀態良好的MDBK細胞，用胰酶消化并調整細胞濃度，適量接種于24孔細胞培養板，置二氧化碳培養箱中培養。第二天待單層細胞融合度達80％左右時，將24孔細胞板內細胞上清棄去，PBS洗滌2次，加入Opti-MEM培養基。然后參照Lipofectamine LTX and Plus^TM Reagent說明書進行轉染：首先配制DNA-脂質體混懸液，取2個1.5mL指形管，其中一個指形管中加入100μL Opti-MEM、1μg RNA和1μL Plus Reagent，另一個指形管中加入100μL Opti-MEM和3μL lipofectamine LTX，輕輕混勻后室溫靜置5min；然后將兩個指形管內的混懸液加到一起，輕柔混勻后室溫靜置25min；將24孔細胞板內細胞上清棄去，加入DNA-脂質體混懸液，然后將24孔細胞板置于二氧化碳培養箱中；靜置培養6h后，將細胞上清換成含10％HS的DMEM完全培養基，然后將細胞置于37℃二氧化碳培養箱中繼續培養。

2.4感染性病毒粒子的鑒定

2.4.1拯救病毒的增殖培養

為了提高拯救病毒的滴度，選用帶毒細胞傳毒的方法進行病毒的增殖培養。轉染體外轉錄物RNA后48～72h，收集并保存第1代細胞培養物上清，PBS清洗細胞一遍，然后用0.02％胰酶消化并按1:3的比例進行傳代培養；待細胞融合度達100％時，再重復上述操作，進行拯救病毒vASH的傳代、增殖培養。

2.4.2間接免疫熒光檢測

將vASH和SH-28分別接種于24孔細胞板內的MDBK細胞，進行間接免疫熒光檢測。培養48h后，棄去細胞上清，PBST洗滌3次，每次5min；室溫干燥后加入200μL 70％乙醇固定細胞，-20℃固定15min；棄去固定液，同上洗滌；然后各孔加入150μL單克隆抗體Bz-53(1:3000)，置于濕盒中37℃孵育1h；棄去一抗，同上洗滌；加入150μL FITC標記的羊抗鼠IgG(1:400)，濕盒中37℃孵育30min；棄去二抗，同上洗滌，最后加入1滴10％的甘油封鏡，然后放置在熒光顯微鏡下觀察結果。同時設置空細胞對照。

2.4.3 RT-PCR檢測

提取第3、5、10代拯救病毒vASH的總RNA并反轉錄成cDNA，然后用BVDV公用檢測引物FBVDVI-II(5’-CATGCCCATAGTAGGAC-3’SEQ ID No.19)/RBVDVI-II(5’-CCATGTGCCATGTACAG-3’SEQ ID No.20)進行PCR擴增，檢測不同代次拯救病毒的病毒含量變化。此外，以第十代拯救病毒的RNA為模板，選取其中4對構建感染性克隆的cDNA擴增引物(SHC～SHF)進行RT-PCR鑒定，并將包含AseI酶切位點的片段(用SHD引物對擴增所得的片段)送上海生物工程有限技術公司測序并分析。

2.4.4病毒滴度增長曲線的繪制

將拯救病毒vASH和親本病毒SH-28分別感染單層MDBK細胞，感染量為1MOI。吸附1h后，棄去細胞上清，然后加入含2％HS的DMEM維持液繼續培養。在感染后第12h、24h、48h、60h、72h分別收集細胞，-20℃保存，并分別測定其TCID₅₀。測定病毒TCID₅₀的具體方法是先將病毒液作連續的10倍稀釋，然后分別接種于96孔細胞板中，100μL/孔，每個稀釋度重復接種8孔；吸附1h后，將細胞上清換成含2％HS的DMEM維持液；培養約72h后，參照本章2.7.2中的操作步驟進行間接免疫熒光檢測，然后按照Reed-Muench方法計算各時間點病毒的TCID₅₀。最后以時間為橫坐標、TCID₅₀為縱坐標，繪制病毒滴度增長曲線。

3.結果

3.1 SH-28株全長cDNA感染性克隆的構建與鑒定

3.1.1 SH-28株基因組cDNA片段擴增

根據豬源BVDV-2分離株SH-28的全基因組序列，設計9對cDNA引物(表1)，提取病毒總RNA，利用RT-PCR方法成功擴增出覆蓋SH-28全基因組的9個cDNA片段，泳道1-9是SHA、SHB、SHC、SHD、SHE、SHF、SHG、SHH和SHI PCR擴增片段，各片段特異性均較好，長度分別為344bp、2194bp、1179bp、3205bp、1281bp、2243bp、2611bp、2539bp和680bp，均與預期相符(圖3)。

3.1.2各cDNA片段克隆質粒的鑒定

將PCR擴增所得的9個cDNA片段切膠回收后，“TA”克隆至pMD 19T Simple載體中，質粒鑒定結果如圖4，泳道1-9為各cDNA重組質粒，大小分別為3036bp、4884bp、3871bp、5897bp、3973bp、4935bp、5303bp、5228bp和3372bp，均與預期相符。用各cDNA片段兩側相應的限制性內切酶進行雙酶切鑒定，酶切結果如圖5，泳道1-9依次酶切為278bp+2758bp、2024bp+2862bp、857bp+3014bp、2695bp+3202bp、750bp+3223bp、1750bp+3185bp、2260bp+3043bp、1159bp+4072bp、544bp+2828bp兩條帶，大小均正確。將鑒定正確的各片段的疑似陽性克隆送上海生物工程有限技術公司測序，經序列比對正確后，獲得各片段的陽性克隆pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E、pMD-F、pMD-G、pMD-H和pMD-I。需要說明的是，pMD-D片段中有個堿基發生了突變，從而導致產生了一個AseI酶切位點，經多次測序的結果都是一致的。

3.1.3全基因組cDNA感染性克隆質粒的鑒定

按照常規操作，將鑒定正確的各cDNA片段按照適當的連接策略進行酶切、連接，最后克隆入pACYC184，獲得豬源BVDV-2分離株SH-28的全基因組cDNA感染性克隆質粒pASH28。選用三組限制性內切酶進行酶切鑒定(圖6)，泳道1是pASH28質粒；泳道2為用EcoRV和PshAI雙酶切質粒的結果，得道3170bp、4303bp和8173bp三條帶；泳道3為用XhoI和XbaI雙酶切的結果，獲得1796bp、3488bp和10362bp三條帶；泳道4為SacI單酶切結果，獲得659bp、6982bp和8005bp三條帶，三組酶切結果均正確，與預期相符。以上鑒定結果說明pASH28是預期的、穩定的豬源BVDV-2全基因組cDNA感染性克隆。

3.2 vASH病毒的拯救與鑒定

3.2.1間接免疫熒光檢測

用MAb Bz-53對第1、3、5代拯救病毒vASH進行間接免疫熒光檢測，結果如圖7，MDBK細胞對照中無綠色熒光(圖7A)，第1代vASH感染細胞孔內的綠色熒光僅一小簇(圖7B)，第3代vASH感染細胞孔中的熒光數量占視野的一大半(圖7C)，而第5代vASH感染細胞孔的視野內全是特異性綠色熒光(圖7D)。說明隨著傳代次數的增加，感染性病毒粒子越來越多，且到第5代時拯救病毒vASH的病毒滴度達到穩定。

3.2.2 RT-PCR檢測

提取第1、3、5代拯救病毒vASH的總RNA，用BVDV公用檢測引物(FBVDVI-II/RBVDVI-II)進行RT-PCR擴增，如圖8，泳道1-3分別代表第1、3、5代病毒，結果表明隨著傳代次數的增加，拯救病毒vASH的病毒含量也逐漸增加。

以第10代vASH總RNA為模板，選取4對引物進行RT-PCR檢測，如圖9，泳道1～4分別是利用擴增引物SHC～SHF進行RT-PCR檢測的結果，均擴增出了預期大小的特異性條帶。為了進一步鑒定vASH的遺傳穩定性，克隆其D片段(使用SHD引物對擴增所得片段)并測序分析，發現該片段的基因序列中仍然存在著一個AseI酶切位點序列，說明拯救病毒在連續的傳代過程中，其遺傳特性仍保持著穩定。

3.3病毒滴度增長趨勢的比較

繪制vASH與親本病毒vASH的病毒滴度增長曲線，發現三者都具有較好的生長特性，且vASH和親本病毒SH-28具有相似的病毒滴度增長趨勢(圖10)。