納米氧化石墨烯在促進小鼠胚胎干細胞培養和自我更新中的應用的制作方法

本發明涉及一種納米氧化石墨烯在促進小鼠胚胎細胞培養和自我更新中的應用。

背景技術：

納米技術是現代科學中新興并高速發展的一個領域。在過去幾年中，納米技術被高效運用于生物醫學研究中，為細胞成像，基因或其他小分子的運載以及組織工程中生物支架的制備提供了新的方法。

胚胎干細胞（ESCs）是從胚胎的囊胚期內細胞團中分離出來的細胞，因其同時具有無限增值能力和多向分化潛能而被廣泛應用于生物醫學和再生醫學研究中。到目前為止，ESCs逐漸應用于臨床疾病的治療，如脊髓損傷、帕金森綜合種、心肌梗塞以及肺纖維化等。因此，對ESCs增殖或分化的精確調控是當前研究的關鍵。研究表明，納米技術與干細胞的結合可能為干細胞的培養及調控帶來重大突破，之前研究主要集中于干細胞的分離示蹤、藥物和基因的運載。如今研究范圍逐漸擴展于納米材料對干細胞自我更新、分化以及細胞命運的調控上。相關研究表明，納米層狀雙氫氧化物（LDH）具有代替白血病抑制因子LIF，維持小鼠胚胎干細胞的自我更新、抑制分化的作用。納米層狀雙氫氧化物是一種陰離子無機片層狀材料，因其具有良好的生物相容性和低毒性，被廣泛應用于生物醫學研究中。

氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）是一種片層狀材料，具有導電性、良好的生物相容性以及表面可修飾性，被越來越多的應用于生物學研究中。相關研究表明，氧化石墨烯對多種干細胞的增殖、分化具有調控作用。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種納米氧化石墨烯在促進小鼠胚胎細胞培養和自我更新中的應用。

本發明提出的納米氧化石墨烯在促進小鼠胚胎細胞培養和自我更新中的應用，具體步驟如下：

(１）通過差速貼壁法將正常培養的小鼠胚胎干細胞去除飼養層細胞，將其按照20000個/孔接種在鋪有1%明膠的六孔板上；

（２）將步驟（１）得到的產物采用完全培養基培養24小時后，去除LIF因子，在完全培養基中添加納米氧化石墨烯，始納米氧化石墨烯終濃度維持在10μg/mL-40μg/mL，繼續培養小鼠胚胎干細胞，添加納米氧化石墨烯后48小時后，即可從形態上顯示其能夠維持小鼠胚胎干細胞的自我更新能力；其中：完全培養基由高糖DMEM；15％胎牛血清；0．1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巰基乙醇；1000U／mL白血病抑制因子組成。

通過堿性磷酸酶染色、Western Blot、熒光定量PCR(rt-PCR)以及免疫熒光染色，表明氧化石墨烯具有維持小鼠胚胎干細胞的自我更新力并抑制其分化的能力。

本發明的有益效果在于；本發明提出了納米氧化石墨烯（GO）用于干細胞培養領域的新用途，在去掉飼養層細胞及無白血病抑制因子（LIF）存在的情況下，能夠維持小鼠胚胎干細胞的自我更新能力。胚胎干細胞在長期培養過程中易發生分化，為了維持胚胎干細胞的自我更新能力，傳統胚胎干細胞的培養需要依賴于飼養層細胞以及白細胞抑制因子，這使得胚胎干細胞的培養成本高昂，培養過程繁瑣，本發明能夠簡化胚胎干細胞的培養流程，降低胚胎干細胞的培養成本。

附圖說明

圖1為氧化石墨烯的透射電鏡圖。

圖2為不同濃度的氧化石墨烯分別處理胚胎干細胞24小時、48小時后對細胞產生毒性的MTT檢測結果。其中：(ａ)為24小時，(ｂ)為48小時。

圖3為不同濃度氧化石墨烯處理4天后的小鼠胚胎干細胞堿性磷酸酶染色。其中：(ａ)為培養液中加入LIF因子和（b）去除LIF因子作為對照組。氧化石墨稀加入后終濃度分別為(ｃ)4mg/mL 、(ｄ)8mg/mL 、(ｅ)16mg/mL、(ｆ)32mg/mL、(ｇ)40mg/mL。

圖4為Western Blot檢測小鼠胚胎干細胞多潛能性和自我更新相關蛋白的表達情況。

圖5為免疫熒光染色檢測多潛能基因的表達。其中：（a）、（b）、（c）、（d）圖分別為不添加lif因子的條件下培養4天后的小鼠胚胎干細胞自我更新標記基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表達情況，（e）、（f）、（g）、（h）圖分別為去掉lif因子的條件下添加氧化石墨烯培養4天后的小鼠胚胎干細胞自我更新標記基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表達情況。

具體實施方式

下面通過實施例結合附圖進一步說明本發明。

實施例1：小鼠胚胎干細胞的培養及氧化石墨烯的作用流程操作

原代獲取小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），培養至3-5代，經80kV的γ-射線處理30min后作為飼養層細胞，1周內使用。小鼠胚胎干細胞采用完全培養基：高糖DMEM，15%胎牛血清， 0.1 mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇，1000U/ml0.1白血病抑制因子，正常培養2-3天后，加胰蛋白酶（0.25%）-EDTA（0.02%）消化細胞，培養液中和胰酶后將細胞置于包被0.1%的培養皿上，靜置培養30分鐘。吸取未貼壁的mESC計數后，按照2×10⁴個/孔接種在鋪1%明膠包被的六孔板上。

培養24小時后，去掉LIF因子，在培養液中加入粒徑大小為200nm的氧化石墨烯溶液，使其終濃度在10-40μg/mL，每天更換具有相同濃度的氧化石墨烯的培養液，連續處理4天后，進行小鼠胚胎干細胞自我更新能力相關指標的檢測。

實施例2：MTT法檢測細胞存活率

mESCs經消化、吹打成單細胞，經差速貼壁法去除飼養層細胞后，按照2×10³個/孔的密度接種于包被明膠的96孔板上，每孔200 μL培養液，過夜培養。次日，將細胞培養液更換為含有氧化石墨烯的培養液，氧化石墨烯的濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3μg/mL。更換不添加氧化石墨烯培養液的細胞設為空白對照組。實驗組和對照組都設立5個復孔。分別在氧化石墨烯處理24 h、48 h對細胞進行檢測。配制5 mg/mL溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑[3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5- diphenylterazolium bromide, MTT] 溶液，用PBS稀釋，pH=7.4，每孔加20 μL。孵育4 h后，吸去孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，水平振蕩10 min。用酶標儀讀取570 nm激發波長下各孔光吸收值，記錄結果并按照公式計算細胞存活率：存活率%=A570（實驗組）/A570（空白對照組）×100 %。

實施例3：氧化石墨烯對小鼠胚胎干細胞自我更新的影響

（1）堿性磷酸酶（ALP）活性檢測。未分化的胚胎干細胞的一個重要生物學特征是能夠表達高濃度的堿性磷酸酶(AP)，通過堿性磷酸酶可以反應出胚胎干細胞的分化狀態。對由實施1獲得的mESC固定后進行堿性磷酸酶染色。如圖2所示，從形態上，去除LIF因子的mESC已完全分化，加入氧化石墨烯的mESC維持未分化狀態，且加入氧化石墨烯的mESC呈堿性磷酸酶強陽性；說明氧化石墨烯能夠促進mESC的自我更新能力。

（2）Western Blot檢測小鼠胚胎干細胞多潛能性和自我更新相關蛋白的表達。Nanog、Oct4、Sox2、Rex-1這些蛋白對ES細胞的自我更新具有重要的調控作用。Western Blot能夠檢測這些蛋白的表達情況，反映細胞所處的狀態。如圖4所示，氧化石墨烯能夠上調這四個基因的表達水平，促進了小鼠胚胎干細胞自我更新能力。

（3）免疫熒光在細胞水平上檢測多潛能基因的表達。選用Rabbit anti-Nanog, Rabbit anti-Oct4, Rabbit anti-Sox2，Mouse anti-SSEA-1作為1抗，Fluorescein Conjugated Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody和Fluorescein Conjugated Goat Anti- Mouse Secondary Antibody 作為2抗，DAPI進行細胞核染色，熒光顯微鏡觀察染色情況。如圖5所示，與對照組相比，氧化石墨烯能夠促進Nanog、Oct4、Sox2和SSEA-1在細胞水平的表達。