穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系、制備方法、應(yīng)用、及豬瘟病毒亞單位疫苗與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系及制備方法、所述重組細(xì)胞系在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應(yīng)用、包含所述重組細(xì)胞系的豬瘟病毒亞單位疫苗以及豬瘟病毒亞單位疫苗的制備方法。

背景技術(shù)：

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種急性高度致死性疾病，強(qiáng)毒株可導(dǎo)致易感豬100％發(fā)病，并導(dǎo)致50％以上的死亡率，國際獸疫局(OIE)將其定為必須通報(bào)的疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。由于不同日齡、性別和品種的豬均可感染發(fā)病，因此豬瘟給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大地經(jīng)濟(jì)損失。該病呈世界性分布，在各養(yǎng)豬國家都有不同程度的流行。目前在中國，豬瘟是影響?zhàn)B豬業(yè)的最重要的疾病。當(dāng)前我國豬瘟發(fā)病狀況具有多樣性，流行范圍較廣，呈散發(fā)流行趨勢(shì)。從感染情況看，發(fā)病日齡小，成年豬帶毒現(xiàn)象嚴(yán)重，非典型和繁殖障礙型豬瘟增多。豬瘟經(jīng)常與豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病、豬鏈球菌病、豬肺疫等混合感染，導(dǎo)致豬的死亡率增加。由于我國大多數(shù)生豬養(yǎng)殖企業(yè)規(guī)模較小，養(yǎng)殖技術(shù)和管理水平相對(duì)落后，豬的死亡率較高達(dá)近12％，由此造成的損失近百億元，這也是導(dǎo)致近些年來豬肉價(jià)格不斷升高的原因之一。

采用免疫接種是目前我國控制豬瘟的主要措施，疫苗質(zhì)量的好壞直接影響疫病的免疫防治效果?，F(xiàn)有技術(shù)中的豬瘟弱毒疫苗(C株)對(duì)世界范圍內(nèi)豬瘟防控發(fā)揮了卓著貢獻(xiàn)。該疫苗目前仍被全世界多個(gè)國家所使用。豬瘟弱毒疫苗分為乳兔苗、免脾淋苗、原代細(xì)胞苗及傳代細(xì)胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又稱為組織苗，是采用健康家兔生產(chǎn)制備的。組織苗的生產(chǎn)需要大量動(dòng)物，且工藝復(fù)雜，成本高；原代細(xì)胞苗及傳代細(xì)胞苗的生產(chǎn)也受到諸多因素困擾，如細(xì)胞培養(yǎng)用血清中的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及抗體會(huì)干擾病毒生長，病毒生產(chǎn)滴度低、產(chǎn)量不穩(wěn)定等。而且母源抗體干擾弱毒疫苗的免疫效果，這也是導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗的因素之一。

CSFV為有囊膜病毒，病毒粒子大小約為40nm至60nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長約12.3kb，包含一個(gè)大的開放性閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)大的具有3898個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白，該多聚蛋白的分子量約為438kDa。豬瘟病毒含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白包括C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白為CSFV的一種重要的囊膜糖蛋白，又稱為gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，是豬瘟病毒主要的免疫保護(hù)性抗原，也是研究豬瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。鑒于現(xiàn)有豬瘟疫苗的種種缺陷與不足，以及隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)與細(xì)胞生物工程技術(shù)的發(fā)展，許多科研人員試圖以現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研制出可以克服現(xiàn)有疫苗缺陷的新型豬瘟疫苗。

這些新型的豬瘟疫苗有病毒活載體疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單位疫苗。目前得到應(yīng)用的有歐洲科研人員研制的以昆蟲桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單位疫苗，該疫苗免疫不受母源抗體影響，而且可以與病毒感染進(jìn)行抗體檢測(cè)鑒別診斷。已有研究表明，用20μg昆蟲細(xì)胞表達(dá)的E2油佐劑疫苗免疫豬，能抵抗CSFV強(qiáng)毒株的攻擊。該疫苗已于上世紀(jì)九十年代在歐洲批準(zhǔn)上市，在歐洲國家的豬瘟根除計(jì)劃發(fā)揮了重要作用。

但該疫苗是通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的，相對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)而言，該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白后可以在一定程度上進(jìn)行翻譯后加工與修飾。但與病毒天然抗原蛋白結(jié)構(gòu)仍有一定差異，蛋白表達(dá)后折疊與修飾不如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。而且該系統(tǒng)生產(chǎn)制備抗原時(shí)，細(xì)胞經(jīng)病毒感染后細(xì)胞會(huì)裂解與死亡，對(duì)下游純化等生產(chǎn)工藝增加難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明探索了利用慢病毒載體介導(dǎo)在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白，并最終找到了合適的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，克服了表達(dá)豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白對(duì)細(xì)胞毒性作用，并且建立了大規(guī)模篩選等技術(shù)。結(jié)果成功制備了穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2蛋白的重組細(xì)胞系。該重組細(xì)胞系表達(dá)E2蛋白的表達(dá)量高。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系的方法，包括以下步驟：

1)提供重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞；

3)通過熒光檢測(cè)法篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞，并對(duì)該單克隆細(xì)胞進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，獲得經(jīng)傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞克?。?/p>

4)檢測(cè)所述細(xì)胞克隆中豬瘟病毒E2蛋白的表達(dá)量，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后仍然能夠表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，

其中所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述豬瘟病毒E2蛋白為豬瘟病毒C株E2蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述方法還包括利用懸浮培養(yǎng)法或靜置培養(yǎng)法培養(yǎng)所得重組細(xì)胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，將所述重組表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述通過熒光檢測(cè)法篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞的步驟包括：通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將表現(xiàn)出綠色熒光的細(xì)胞群體進(jìn)行有限稀釋，從而篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述多次傳代培養(yǎng)為進(jìn)行2-50次傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的第七方面，在根據(jù)本發(fā)明的第一方面或第六方面所述的方法中，在步驟4)中，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后能夠表達(dá)至少100ug/ml的豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種根據(jù)本發(fā)明第一至第七方面任一方面所述的方法獲得的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了一種豬瘟病毒亞單位疫苗，其包含有效劑量的由根據(jù)本發(fā)明第六方面所述的重組細(xì)胞系表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白和佐劑。

根據(jù)本發(fā)明的第十方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述佐劑為礦物油佐劑。

根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述含豬瘟病毒E2蛋白的抗原液與佐劑的重量比為1:1至1:2。

根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述豬瘟病毒亞單位疫苗每頭份包含濃度為30ug至50ug的豬瘟病毒E2蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的第十三方面為根據(jù)本發(fā)明第八方面所述重組細(xì)胞系在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，包括以下步驟：

將根據(jù)第八方面所述的重組細(xì)胞系逐級(jí)放大培養(yǎng)至細(xì)胞密度為10⁷個(gè)以上時(shí)，連續(xù)收集培養(yǎng)上清液；

將所述上清液與佐劑按重量比1:1～1:2進(jìn)行混合。

根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，在根據(jù)本發(fā)明第十四方面所述的方法中，所述佐劑為礦物油佐劑。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.將本發(fā)明的表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白制備成疫苗，免疫動(dòng)物后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)CSFV的高效價(jià)抗體，抗體產(chǎn)生早且持續(xù)時(shí)間長，并能抵抗強(qiáng)毒的攻擊與感染。

2.本發(fā)明所選用的表達(dá)系統(tǒng)為真核(例如HEK-293T)細(xì)胞，得到的重組細(xì)胞系(例如HEK-293T-CE2)具有與親本細(xì)胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規(guī)模生產(chǎn)；表達(dá)蛋白在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)能得到接近病毒蛋白的天然構(gòu)象與修飾加工，抗原性好。

3.本發(fā)明的重組細(xì)胞系可以懸浮或靜止培養(yǎng)，適合于規(guī)模化大生產(chǎn)；細(xì)胞培養(yǎng)過程中不涉及到豬瘟病毒，具有良好的生物安全性。

4.本發(fā)明構(gòu)建的重組細(xì)胞系蛋白表達(dá)量高，最低產(chǎn)量可達(dá)200mg/L，生產(chǎn)成本低。

5.本發(fā)明構(gòu)建的重組細(xì)胞系含有綠色熒光蛋白，有利于細(xì)胞的篩選和克隆。

6.本發(fā)明的E2表達(dá)蛋白可以含有組氨酸標(biāo)簽，利于后期純化。

7.利用本發(fā)明蛋白制備的疫苗免疫動(dòng)物后，不產(chǎn)生豬瘟病毒E0蛋白抗體以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，可以利用檢測(cè)豬瘟病毒E0蛋白抗體或非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來對(duì)疫苗免疫與病毒感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別。

8本發(fā)明所制備的豬瘟疫苗為亞單位疫苗，不受母源抗體干擾，臨床使用方便。

9.本發(fā)明表達(dá)的E2蛋白抗原能對(duì)免疫豬誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，免疫豬可以完全抵抗豬瘟強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)株即石門株的攻擊。該細(xì)胞系表達(dá)抗原所制備的疫苗可為豬瘟的預(yù)防提供新型、高效的預(yù)防制劑。對(duì)我國乃至世界范圍內(nèi)豬瘟的預(yù)防控制可以發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；

圖2為不同細(xì)胞克隆表達(dá)目的基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，其中M:Marker DL2000，大小依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,200bp和100bp；泳道1-5分別為：C1、C5、C7、C8和C9克隆細(xì)胞(C表示不同細(xì)胞克隆編號(hào))；6：293T對(duì)照細(xì)胞；

圖3為不同代次細(xì)胞克隆表達(dá)的E2蛋白的SDS-PAGE結(jié)果，其中M：Marker，大小依次為98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分別為：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液(C表示細(xì)胞克隆編號(hào)，F(xiàn)表示細(xì)胞傳代代次，例如C5F19表示C5克隆細(xì)胞第19代，如此類推)；

圖4為不同代次細(xì)胞克隆表達(dá)的E2蛋白的Western Blot結(jié)果，其中M：Marker，大小依次為198KDa,98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分別為：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液(C表示細(xì)胞克隆編號(hào)，F(xiàn)表示細(xì)胞傳代代次，例如C5F19表示C5克隆細(xì)胞第19代，如此類推)；

圖5為家兔免疫后攻毒的體溫檢測(cè)結(jié)果；

圖6為2周齡仔豬免疫后血清豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果，其中阻斷率≥40％為抗體陽性。

圖7為60日齡豬免疫后血清豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果，其中阻斷率≥40％為抗體陽性。

具體實(shí)施方式

下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明提供了一種制備穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞；

通過熒光檢測(cè)法篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞，并對(duì)該單克隆細(xì)胞進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，獲得經(jīng)傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞克??；

檢測(cè)所述細(xì)胞克隆中豬瘟病毒E2蛋白的表達(dá)量，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后仍然能夠表達(dá)(優(yōu)選表達(dá)量不低于100ug/ml)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，

其中所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將豬瘟病毒PCR產(chǎn)物回收后，與載體連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

(2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞；

(3)通過熒光檢測(cè)篩選表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞，利用有限稀釋法對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行克??；

(4)收獲克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)并比較豬瘟病毒E2蛋白表達(dá)量，獲得穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，

其中，所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。

在本發(fā)明中，術(shù)語“穩(wěn)定表達(dá)”是指細(xì)胞系在經(jīng)過連續(xù)傳代(例如50代)后仍然能夠表達(dá)外源豬瘟病毒E2蛋白，優(yōu)選所述表達(dá)的表達(dá)量不低于100ug/ml。

在本發(fā)明中，術(shù)語“有效連接”是指所述豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和所述綠色熒光蛋白編碼序列位于同一個(gè)編碼框中，能夠被通讀，從而被表達(dá)為重組蛋白。

在本發(fā)明中，豬瘟病毒E2蛋白優(yōu)選為具有良好免疫原性的豬瘟病毒C株E2蛋白，該毒株制備的疫苗為全世界公認(rèn)的最優(yōu)豬瘟活疫苗。

在本發(fā)明中，本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系可懸浮培養(yǎng)或靜止培養(yǎng)，優(yōu)選懸浮培養(yǎng)。采用懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)重組細(xì)胞系，上清中的表達(dá)蛋白濃度可以提高十倍，且便于企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)豬瘟E2蛋白亞單位疫苗。

在本發(fā)明中，能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，命名為HEK-293T-CE2，分類命名為人胚胎腎細(xì)胞(human kidney epithelial cells)。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述通過熒光檢測(cè)法篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞的步驟包括：通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將表現(xiàn)出綠色熒光的細(xì)胞群體進(jìn)行有限稀釋，從而篩選出表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒的單細(xì)胞。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的所述的方法獲得的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種安全、高效的豬瘟病毒亞單位疫苗，其包含有效劑量的經(jīng)所述重組細(xì)胞系表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白和佐劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述佐劑為礦物油佐劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述豬瘟病毒E2蛋白與佐劑的重量比為1:1。

在本發(fā)明中，所述豬瘟病毒亞單位疫苗每頭份包含30-50ug的豬瘟病毒E2蛋白。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述重組細(xì)胞系及其培養(yǎng)物在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將本發(fā)明所述的重組細(xì)胞系逐級(jí)放大培養(yǎng)至細(xì)胞密度為10⁷以上時(shí)，連續(xù)收集培養(yǎng)上清，經(jīng)離心取上清貯存于-40℃度以下保存；

(2)將培養(yǎng)液上清與佐劑按重量比1:1～1:2進(jìn)行乳化，制備雙項(xiàng)油佐劑疫苗。

在本發(fā)明中，所述佐劑優(yōu)選為礦物油佐劑。

本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系可懸浮或靜止培養(yǎng)，細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞連續(xù)傳代后蛋白分泌穩(wěn)定，表達(dá)量高，蛋白與佐劑制備成疫苗后免疫豬能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)豬瘟病毒抗體，可抵抗豬瘟病毒強(qiáng)毒攻擊。

實(shí)施例

實(shí)施例1穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系的構(gòu)建與檢測(cè)

1.1材料和方法

1.1.1菌株、載體和主要試劑

轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen購自漢恒生物。

JM109感受態(tài)細(xì)胞、RNA提取試劑盒、PrimeStar高保真聚合酶、DNA Marker為Takara產(chǎn)品；Reverse Transcription System、4-12％Bis-Tris Gel、SeeBlue Plus2pre-stained strandard為ThermoFisher公司產(chǎn)品；PGEM-T為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Omega產(chǎn)品；XbaI為NEB產(chǎn)品；DMEM/F12(1:1)、Foetal Bovine Serum為GIBCO產(chǎn)品；Anti-Mouse IgG(Fc Specific)-peroxidase antibody produced in goat為Sigma產(chǎn)品；Vector VIP Peroxidase(HRP)substrate kit為Vector Laboratories產(chǎn)品；Plasmid maxi Kit為QIAGEN產(chǎn)品；豬瘟病毒E2蛋白抗體ELISA試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品；HEK293T細(xì)胞購自漢恒公司。

1.1.2目的片段的擴(kuò)增和純化

根據(jù)Genebank中CSFV C株E2序列(登錄號(hào)AY663656.1)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(見表1)，由上海立菲生物科技有限公司合成。

表1 E2擴(kuò)增引物

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，用隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收記為E2-1，以E2-1為模板，F(xiàn)1/R2為引物再次進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物回收記為E2。

將PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109細(xì)胞，取100μl涂布含有氨芐的LB瓊脂，37℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR的方法鑒定重組子，挑選陽性克隆送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.1.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

CSFV-E2基因大小為1050bp，在起始密碼子前加有kozak序列和XbaI酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基；在E2蛋白基因編碼末端加有終止密碼子、His標(biāo)簽和BamHI酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基，完整的編碼序列如SEQ NO.1所示。輔助質(zhì)粒pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen用XbaI、BamHI雙酶切處理，然后與經(jīng)XbaI、BamHI雙酶切回收的CSFV-E2基因在T4DNA連接酶作用下連接，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑選單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用XbaI、BamHI雙酶切對(duì)其進(jìn)行鑒定；酶切鑒定陽性質(zhì)粒命名為pHBLV-CSFV-E2，同時(shí)送生物公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖1.

1.1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

選生長良好的HEK293T細(xì)胞消化傳代至T25細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60％至80％時(shí)，將包裝所需質(zhì)粒pHBLV-E2按LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)3天后將細(xì)胞用胰酶消化，有限稀釋法將細(xì)胞傳代于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，10至15天后在熒光顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞的克隆數(shù)，挑選含有一個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊并且有明亮熒光的孔相繼在24孔細(xì)胞板、6孔細(xì)胞板)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)收集各個(gè)克隆細(xì)胞上清用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。

1.2結(jié)果

1.2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pHBLV-CSFV-E2結(jié)構(gòu)圖見圖1。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI、BamHI雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有兩條帶，酶切產(chǎn)物電泳帶型與預(yù)期結(jié)果一致，同時(shí)測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中XbaI、BamHI酶切位點(diǎn)間的序列和設(shè)計(jì)的編碼E2蛋白的基因完全一致。

1.2.2 E2基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

1.2.2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

轉(zhuǎn)染后3天，通過有限稀釋法將不同稀釋度細(xì)胞置于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每天在熒光顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞，對(duì)出現(xiàn)有單個(gè)熒光細(xì)胞的培養(yǎng)孔進(jìn)行標(biāo)記，篩選出5個(gè)陽性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2.2克隆細(xì)胞的RT-PCR鑒定

取5個(gè)不同克隆細(xì)胞和親本293T細(xì)胞各一支，離心后取沉淀，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取6μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入Oligo dT 1μL,Annealing Buffer 1uL,2X First-Strand Reaction Mix 10μL和2μL的SuperScript III/RNaseOUT Enzyme Mix，充分混勻，50℃加熱50分鐘，85℃、5分鐘終止反應(yīng)，獲得cDNA。然后以獲得的cDNA為模板，利用CSFV-E2基因特應(yīng)性引物(F1,R1)，PCR擴(kuò)增目的基因，均能檢測(cè)到目的基因片段。結(jié)果參見圖2。

1.2.3 E2表達(dá)細(xì)胞系的篩選

1.2.3.1收取C1、C5、C7、C8和C9這5個(gè)克隆細(xì)胞在相同條件下的培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE，比較不同克隆細(xì)胞E2蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明C5細(xì)胞克隆蛋白表達(dá)量最高，選取C5細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)與進(jìn)一步特性分析。C5克隆細(xì)胞經(jīng)過不同代次傳代后，對(duì)培養(yǎng)上清液中CSFV-E2含量進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，結(jié)果表明篩選出的克隆細(xì)胞系在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達(dá)水平。由上述結(jié)果可以看出構(gòu)建的重組細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白。

1.2.3.2表達(dá)E2蛋白的Western Blot檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)上清E2蛋白經(jīng)SDS-PAGE，再用特異性單抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明篩選出的克隆細(xì)胞系在連續(xù)傳代后表達(dá)的蛋白均與單抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)蛋白的活性沒有發(fā)生變化(圖4)。

將得到的能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的細(xì)胞克隆，命名為HEK293T-CE2。

實(shí)施例2豬瘟E2亞單位疫苗對(duì)家兔的免疫效力試驗(yàn)

2.1試驗(yàn)方法

2.1.1疫苗制備及免疫

將含量為50ug/ml的E2蛋白細(xì)胞培養(yǎng)上清液與油佐劑按重量比1:1混合后，在室溫條件下以300RPM攪拌5分鐘制備成疫苗。將6只日本大耳白家兔隨機(jī)分為2組，其中4只為免疫組，每只經(jīng)肌肉注射1ml疫苗(含有20ug E2蛋白)，另外2只不免疫作為對(duì)照組。

2.1.2抗體檢測(cè)

免疫后，在第14天及21天采血，血清用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體。

2.1.3攻毒

免疫后21天，免疫組和對(duì)照組同時(shí)經(jīng)耳靜脈接種1ml兔化弱毒(含5000家兔感染量)。接種后，定時(shí)測(cè)量體溫。

2.2結(jié)果

2.2.1血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

家兔接種后第14天及21天豬瘟ELISA抗體均為陽性，阻斷率詳細(xì)見下表1。

表1家兔免疫后的豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果

注：按試劑盒說明進(jìn)行計(jì)算，阻斷率≥40％為抗體陽性。

其中表示陰性對(duì)照平均

2.2.2攻毒試驗(yàn)結(jié)果

家兔免疫后第21天，用豬瘟兔化弱毒攻擊，對(duì)照組均出現(xiàn)豬瘟兔化弱毒所導(dǎo)致的定型熱反應(yīng)，而免疫組家兔體溫均正常，表明家兔接種后可產(chǎn)生中和抗體，能中和豬瘟兔化弱毒。體溫結(jié)果參見圖5。

實(shí)施例3豬瘟E2亞單位疫苗對(duì)豬的免疫效力試驗(yàn)

3.1.1.1對(duì)2周齡仔豬的免疫效力

(1)分組：將15頭CSFV抗體檢測(cè)為陰性的2周齡仔豬隨機(jī)分為3組，每組5頭豬，第一組為弱豬瘟活疫苗免疫組，第二組為豬瘟亞單位疫苗免疫組，第三組為空白對(duì)照組。

(2)免疫：第一組按使用說明書每頭豬免疫1頭份商品化的豬瘟活疫苗；第二組每頭豬經(jīng)肌肉注射接種1ml的實(shí)施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第三組不免疫作為空白對(duì)照組。

(3)抗體檢測(cè)：豬瘟活疫苗免疫組、豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫組和對(duì)照組均在接種后第14天、第28天、第42天采血，采集的血清用商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。

3.1.1.2對(duì)60日齡豬的免疫效力

(1)分組：將15頭CSFV抗體檢測(cè)為陰性的60日齡豬隨機(jī)分為3組，每組5頭豬，第一組為免疫組(一免組)，第二組為加強(qiáng)免疫組(二免組)，第三組為空白對(duì)照組。

(2)免疫：第一組每頭豬經(jīng)頸部肌肉接種2ml實(shí)施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第二組每頭豬經(jīng)頸部肌肉注射接種2ml實(shí)施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗，一免后21天每頭豬再經(jīng)頸部肌肉注射接種2ml實(shí)施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第三組不免疫作為空白對(duì)照。

(3)抗體檢測(cè)：一次免疫(一免)組在接種后第14天、第21天和第28天采血；二次免疫(二免)組在一免后第14天及第21天，二免后第7天(即一免后28天)及第14天(即一免后第35天)采血；對(duì)照組與二次免疫組同時(shí)間采血采集的血清用商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。

(4)攻毒：一次免疫組在免疫后第28天，二次免疫組在加強(qiáng)免疫后14天(即首免后35天)按《中國獸藥典》方法用豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊，攻毒后每日觀察試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)、食欲與體溫等指標(biāo)。

3.2結(jié)果

3.2.1血清學(xué)結(jié)果

(1)2周齡仔豬血清學(xué)結(jié)果：用豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫2周齡仔豬后14天，5頭豬的ELISA抗體平均阻斷率為43.85％，28天升高至67.3％，而42天進(jìn)一步升高至74.96％，其抗體水平與豬瘟活疫苗免疫后相似，詳細(xì)結(jié)果參見圖5。

(2)60日齡豬的血清學(xué)結(jié)果：用豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫60日齡仔豬后14天，兩個(gè)免疫組豬瘟ELISA抗體均為陽性。一次免疫組接種后抗體繼續(xù)升高至28天的77.15％；二次免疫組首免后21天的抗體變化與一次免疫組相似，但21天加強(qiáng)免疫后7天(即首免后28天)抗體迅速上升到較高水平，14天(首免后35天)與7天抗體相似，維持在高水平。詳細(xì)結(jié)果參見圖6。

3.2.2攻毒試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后，兩個(gè)免疫組豬均未出現(xiàn)任何豬瘟臨床癥狀，剖檢時(shí)淋巴結(jié)、臟器均無任何肉眼可見病理變化；而未免疫對(duì)照組豬攻毒后48小時(shí)體溫均開始升高，精神沉郁，食欲減退或廢絕，5頭豬分別于攻毒后9-15天內(nèi)死亡，死亡豬剖檢均呈現(xiàn)典型的豬瘟癥狀。

血清學(xué)和免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗免疫豬后能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的保護(hù)性抗體，且對(duì)強(qiáng)毒攻擊可提供100％的保護(hù)。