一株醋酸桿菌及在加速綠豆淀粉分離沉降中的應用的制作方法

本發明涉及一株醋酸桿菌及在加速綠豆淀粉分離沉降中的應用。技術背景醋酸菌能改善食品的風味、品質和營養、延長保質期，具有調節人體腸道菌群平衡、抑制病原菌的生長、降低膽固醇、提高免疫力、延緩衰老等重要的生理保健作用，被廣泛應用于食品行業，醋酸菌發酵食品也被認為是功能性食品。目前，綠豆淀粉的生產采用自然靜置法或酸漿法，靜置法不但費時而且淀粉去除不徹底；酸漿法淀粉分離效果較靜置法好，但是由于酸漿是自然發酵的產物，受原料、氣候變化等環境因素及操作方法的影響很大，產品質量很不穩定，有時由于溫度或其他因素造成發酵過度，酸漿質量變劣；有時酸漿活力不足，使得淀粉不能與蛋白質等其他雜質及時有效分離。造成這些問題的主要原因是由于對酸漿中分離沉淀淀粉的主要作用菌認識還不是十分清楚，因此也一直沒有人工制備的、可用于酸漿生產的發酵劑開發，還不能進行人工接種發酵。技術實現要素：：本發明的目的就是針對綠豆淀粉分離沉淀時間長、淀粉分離沉淀不徹底、產品的質量不穩定等問題，提供一株促進淀粉分離沉降能力強的醋酸桿菌，該醋酸桿菌能夠在加速綠豆淀粉沉降分離的過程中起到關鍵作用。本發明的另一目的在于，該醋酸桿菌在加速淀粉分離沉降中的應用，提高淀粉的得率，使產品的穩定性提高。同時，本發明中的酸漿為純菌發酵，無雜菌等致病菌污染，提高了淀粉產品的食用安全性。本發明是通過以下技術方案實現的：本發明提供一株促淀粉分離沉降的醋酸桿菌，該醋酸桿菌為醋酸桿菌AcetobacterindonesiensisLLY11，已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12794。所述的醋酸桿菌菌株的個體形態特征：大小為（0.8μm～1.2μm）×（1.5μm～2.5μm），細胞橢圓或短桿，革蘭氏陰性，無芽孢。菌落形態特征：菌落大小在2mm～3mm，乳黃色，不透明，菌落邊緣整齊，表面光滑、濕潤有光澤，隆起呈半球狀。生理生化特征為：耐氧，過氧化氫酶陽性，不能運動，硫化氫、硝酸鹽還原、明膠實驗陰性，代謝葡萄糖產酸不產氣，能代謝果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、蜜二糖、纖維二糖產酸，不能利用棉籽糖、阿拉伯糖。該菌株的16SrDNA序列全長共1411bp，經Genbank比對與Acetobacterindonesiensis相似性達到99%；結合其個體、群體形態特征及生理生化實驗結果，鑒定該菌為Acetobacterindonesiensis，并命名為AcetobacterindonesiensisLLY11。醋酸桿菌AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿的制備：用接種環挑取三環斜面保藏的醋酸桿菌AcetobacterindonesiensisLLY11于5mL綠豆汁培養基中，30℃下發酵12h后，將這5mL發酵液擴大培養，繼續接入100mL綠豆汁培養基中30℃下發酵12h，獲得AcetobacterindonesiensisLLY11的種子培養液。按5%-8%的接種量將種子培養液接入到綠豆汁培養基中，30℃下發酵12h，即可獲得用于沉降綠豆淀粉乳的酸漿。醋酸桿菌AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿在沉淀淀粉中的應用：將上述AcetobacterindonesiensisLLY11純菌發酵獲得的酸漿按體積比10%的量加入到綠豆淀粉乳中，迅速攪拌1-2min，然后靜置。該菌株能夠特異性結合到淀粉顆粒表面，將眾多淀粉顆粒聯結成大的絮凝團，由于聯結在一起的淀粉顆粒重力加大，加速了淀粉與蛋白質等雜質的分離沉降速度，可以將沉降速度由20min（100mL綠豆淀粉乳中沉淀10mL淀粉所需時間）縮短至2min。AcetobacterindonesiensisLLY11純種發酵酸漿與自然發酵綠豆酸漿在綠豆淀粉生產中應用于具有以下優點：⑴提高了淀粉沉降速度，縮短了淀粉沉淀時間，提高淀粉得率；⑵AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿為純菌發酵，無雜菌等致病菌污染，提高了淀粉產品的食用安全性。具體實施方式實施例1加速淀粉沉降微生物的分離、篩選與鑒定1培養基⑴綠豆汁培養基配方：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸鈉5g、綠豆汁1000mL。⑵綠豆汁的制備方法：取100g綠豆加蒸餾水至1000mL，加熱煮沸20min，用120目的篩子過濾，即得綠豆汁。⑶分離培養基：以可溶性淀粉替代綠豆汁培養基中葡萄糖作為碳源，具體成分及其配備如下：酵母膏5g、K2HPO42g、可溶性淀粉20g、乳糖2g、醋酸鈉5g、綠豆汁1000mL。調pH至6.8，115℃滅菌30min。2檢測方法2.1綠豆淀粉沉降速度的檢測方法：取泡發8-12h的綠豆，按1:15的比例加水打漿，取100mL打好的綠豆淀粉乳若干份，分別加入自然發酵酸漿、純菌發酵液和空白綠豆汁培養基，分別測定沉降10mL淀粉所需要的時間。每組做3個重復。2.2大腸菌群的檢測方法：參照GB47893-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。3加速淀粉沉降微生物分離方法3.1樣品的稀釋用無菌吸管吸取自然發酵的綠豆酸漿5mL，移入盛有45mL無菌生理鹽水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振搖均勻，即為10-1的樣品稀釋液。用無菌生理鹽水對10-1的樣品稀釋液進行梯度稀釋至10-7。3.2平板分離培養取上述10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液各1mL分別注入無菌培養皿中，每個稀釋度做3個重復。注入分離培養基，待培養基凝固后，倒置于30℃溫箱中培養24h～48h。3.3平板接種培養用接種環挑取單個小菌落，劃線接種于分離培養基平板中，30℃培養24h，反復純化3代，得到單菌落接種于綠豆汁斜面培養基上，30℃培養24h。3.4菌株篩選將分離到的斜面純菌株活化后接入以可溶性淀粉替代葡萄糖的綠豆汁培養液中，30℃培養24h，以發酵液的加速淀粉分離沉降速度為指標，篩選出一株促淀粉分離沉降速度高的菌株LLY11。3.5菌種鑒定3.5.1菌株LLY11的形態特征觀察將菌株LLY11在綠豆汁瓊脂培養基中30℃下培養24h，然后進行革蘭氏染色，其個體形態特征見表1。3.5菌種鑒定3.5.1菌株LLY11的形態特征觀察將菌株LLY11在綠豆汁瓊脂培養基中30℃下培養24h，然后進行革蘭氏染色，其個體形態特征見表1。表1LLY11菌株的個體形態特征菌株菌體大小細胞形態細胞分裂后的排布方式革蘭氏染色芽孢運動性LLY110.8μ～1.2μm）×（1.5μm～2.5μm）細胞橢圓或短桿鏈狀革蘭氏陰性無不運動菌株LLY11在綠豆汁瓊脂培養基，30℃下培養48h，觀察菌落大小、形態和顏色，結果見表2。表2菌落形態特征3.5.2LLY11的生理生化特征根據常規生理生化鑒定，結果見表3，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步判斷菌株LLY11為醋酸桿菌屬。表3菌株生理生化特性測試項目結果測試項目結果過氧化氫酶+乳糖+運動性試驗-半乳糖+H2S試驗-麥芽糖+硝酸鹽還原-甘露醇+明膠液化-山梨醇+15℃生長+棉子糖-45℃生長-甘露糖+葡萄糖酸鹽+鼠李糖+葡萄糖產氣-松三糖+葡萄糖產酸+蜜二糖+木糖-七葉糖+果糖+阿拉伯糖-蔗糖+纖維二糖+3.5.3醋酸桿菌LLY11的16SrDNA序列分析結果該菌株的16SrDNA序列全長共1411bp，經Genbank比對與Acetobacterindonesiensis相似性達到99%，綜合其群體形態觀察、個體形態觀察、生理生化試驗結果，確定該菌株為Acetobacterindonesiensis并命名為AcetobacterindonesiensisLLY11，已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所，郵編100101），保藏編號為CGMCCNo.12794。實施例2AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿在淀粉加工中的應用1實驗材料試驗用的菌株為本發明分離的AcetobacterindonesiensisLLY11，淀粉生產原料選擇綠豆。2AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿的制備⑴綠豆汁培養基配方：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸鈉5g、綠豆汁1000mL。⑵綠豆汁的制備方法：取100g綠豆加蒸餾水至1000mL，加熱煮沸20min，用120目的篩子過濾，即得綠豆汁。⑶醋酸桿菌LLY11種子培養液制備方法：用接種環挑取三環斜面保藏的醋酸桿菌LLY11于5mL綠豆汁培養基中30℃下發酵12h后，將這5mL發酵液擴大培養，繼續接入100mL綠豆汁培養基中30℃下發酵12h，獲得醋酸桿菌LLY11的種子培養液。⑷將醋酸桿菌LLY11種子培養液按5%-8%的接種量接入到綠豆汁培養基中，30℃下發酵12h，即可獲得用于沉降綠豆淀粉乳的發酵酸漿。3應用于加速淀粉與蛋白質等雜質分離沉降將AcetobacterindonesiensisLLY11發酵獲得的酸漿按體積比10%的量加入到綠豆淀粉乳中，迅速攪拌1-2min，然后靜置。分別取加入AcetobacterindonesiensisLLY11發酵液前后的綠豆淀粉乳，在顯微鏡下觀察淀粉顆粒的分布，見圖1、圖2，由圖可以看出，AcetobacterindonesiensisLLY11能夠特異性結合到淀粉顆粒表面，將眾多淀粉顆粒聯結成大的絮凝團。由于聯結在一起的淀粉顆粒重力加大，加速了淀粉與蛋白質等雜質的分離沉降速度，可以將沉降速度由20min（100mL綠豆淀粉乳中沉淀10mL淀粉所需時間）縮短至2min。附圖說明圖1為在100倍顯微鏡下觀察加入發酵液之前的綠豆淀粉顆粒分布圖；圖2為加入10%AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿后，綠豆淀粉顆粒聯結成大的絮凝團。沉降效果比較見表4；4大腸菌群的檢測數量:分別對AcetobacterindonesiensisLLY11發酵酸漿和自然發酵綠豆酸漿中大腸菌群的數量進行檢測，結果如下表5:本發明從自然發酵綠豆酸漿中篩選出一株可以加速淀粉沉降的AcetobacterindonesiensisLLY11，并將其應用于綠豆酸漿發酵中，其發酵液可加速綠豆淀粉分離沉降。該發明不僅縮短了淀粉分離沉降的時間，提高了淀粉得率，使產品的穩定性提高；而且發明中的酸漿為純菌發酵，無雜菌等致病菌污染，提高了淀粉產品的食用安全性。SEQUENCELISTING<110>錦州醫科大學<120>一株促淀粉分離沉降的醋酸菌<130>在加速綠豆淀粉分離沉降中的應用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1411<212>DNA<213>Acetobacterindonesiensis<400>1gtggtcggctgcgccccttgcgggttcgctcaccggcttaaggtcaaaccaactcccatg60gtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg120attactagcgattccaccttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccgaactgagacgg180cttttagagatcagcacgatgtcgccatctagcttcccactgtcaccgccattgtagcac240gtgtgtagcccaggacataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggc300ttgtcaccggcagtctctctagagtgcccacccaaacatgctggcaactaaagatagggg360ttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgca420gcacctgtgcgg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