苯甲酸三氮唑類抗流感病毒化合物及其制備方法和用途與流程

本發(fā)明涉及藥物化學領域，具體涉及一類苯甲酸三氮唑類抗流感病毒化合物、它們的制備方法以及它們的醫(yī)藥用途。

背景技術：

由病原性微生物流感病毒引起的流行性感冒是一種嚴重威脅人類生命和健康的呼吸道傳染性疾病，其傳染性強，分布面廣，患者急起高熱、全身疼痛、顯著乏力。流感病毒可分為不同亞型，如A/California/7/2009(H1N1)、A/Beijing/32/92(H3N2)、A/Vienam/1203/2004(H5N1)、Anhui/1/2013(H7N9)等。流感病毒可以引起非常嚴重的并發(fā)癥和死亡，對其預防和控制耗費著大量的社會資源。

鑒于疫苗研發(fā)相對滯后，目前臨床上使用的特異性抗流感病毒藥物主要是M2離子通道阻斷劑(如金剛烷胺和金剛乙胺)、神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑(如奧司他韋和扎那米韋)和RNA聚合酶抑制劑(如利巴韋林)等。金剛烷胺和金剛乙胺用于流感的預防和治療已有30多年的歷史，但因存在神經(jīng)毒性和對乙型流感毒無效等缺陷，限制了其臨床上的廣泛應用。以流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑為代表的抗病毒藥物成為迄今抵抗流感最有效的策略。目前臨床應用最廣泛的藥物奧司他韋(Oseltamivir，商品名：達菲)和扎那米韋(Zanamivir，商品名：瑞樂沙)通過與NA催化中心的結合，選擇性抑制NA的活性，阻止子代病毒顆粒的釋放和擴散，從而有效治療流感和緩解流感癥狀。但隨著給藥的增多，奧司他韋耐藥毒株頻現(xiàn)，NA的酶活性位點與抑制劑的親和力降低，極大地限制了對耐藥性流感的治療效果。此外，奧司他韋和扎那米韋由于都含有多個手性中心，合成其光學異構體的步驟繁瑣，成本高，使得這些藥物價格昂貴。

1999年Wayne J.BrouiLLette等在專利WO99/14191發(fā)現(xiàn)了苯甲酸類化合物BANA-206為一個活性較好的苯甲酸類神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其對NA的抑制作用達到納摩爾級。2006年Li等在Bioorg.Med.Chem.Lett.報道了通過在側鏈引入三氮唑類取代基，可得到與扎那米韋活性相近的化合物，該類化合物對細胞培養(yǎng)的流感病毒株具有高選擇的抗病毒活性。我們以苯甲酸類化合物作為母核，運用拼合原理和功能團原理，在其3位側鏈引入三氮唑類取代基，以期獲得高活性的抗流感病毒化合物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一系列苯甲酸三氮唑類抗流感病毒化合物。藥理試驗結果顯示，本發(fā)明化合物在體內(nèi)外對流感病毒及奧司他韋耐藥突變株均具有高效的抑制效果。因此，本發(fā)明的通式Ⅰ化合物，可用于流感的治療。

本發(fā)明苯甲酸三氮唑類抗流感病毒化合物不含手性中心，合成步驟簡便，對多種流感病毒(包括奧司他韋耐藥突變株)有效，具有廣闊的應用前景。

本發(fā)明的化合物通式Ⅰ如下：

其中R₁代表：COOH或COO(CH₂)n CH₃，n＝0-6；

R₃、R₄各自獨立地代表：氫或羥甲基，且R₃、R₄不同時為氫；

R₂代表C₁-C₆的烷基、苯基、芐基、萘基、苯乙烯基或含有1-2個選自O或N的五元或六元雜環(huán)基，或被下列任一取代基取代的上述基團：C₁-C₆的烷基、羥基、硝基、甲氧基、乙氧基、鹵素或氨基。

其中R₁優(yōu)選代表COOH、COOCH₃或COOCH₂CH₃。

R₂優(yōu)選代表：

最優(yōu)選的化合物結構式為：

本發(fā)明的部分優(yōu)選的化合物如下：

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-[5-(2-甲基苯基)-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-1)

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(-萘基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-2)

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-仲丁基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-3)

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-異戊基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-4)

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-環(huán)己基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-5)

本發(fā)明的化合物制備方法如下：

本發(fā)明中關鍵中間體(Ⅱ)3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯的制備如下：

關鍵中間體(Ⅲ)3-氨基-4-[2-(羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯的制備如下：

本發(fā)明開展了該化合物運用于治療流感病毒感染的研究，在體外通過流感病毒細胞感染模型證明了化合物對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)和A/Beijing/32/92(H3N2)具有明顯的抑制活性，其EC₅₀值分別為33.6μM和141.7μM，同時該化合物對奧司他韋耐藥突變株A/FM/1/47-H275Y(H1N1-H275Y)也表現(xiàn)出顯著的抑制作用，EC₅₀值為35.2μM。在體內(nèi)通過流感病毒小鼠感染模型證明了口服給藥本發(fā)明化合物對A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠有顯著的生存保護和體重作用，可明顯減輕流感病毒感染癥狀，延長生存時間。

本發(fā)明化合物的藥學上可接受的鹽具有與化合物同樣的藥效。所述的藥學上可接受的鹽優(yōu)選本發(fā)明化合物與下列算加成的鹽：鹽酸、氫溴酸、甲磺酸、羥基乙磺酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、馬來酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硝酸、磷酸、硼酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、苯甲酸、抗壞血酸或水楊酸等。

本發(fā)明還提供了一種治療流感病毒的藥物組合物，其中含有治療有效量的通式Ⅰ化合物和藥學上可接受的載體。所述藥物組合物可以是普通片劑或膠囊、緩釋片劑或膠囊、控釋片劑或膠囊、口服液、注射劑等制劑學上常規(guī)的制劑形式。

一般地，本發(fā)明的抗流感病毒化合物用于治療時，人用劑量范圍為lmg～1000mg/天。也 可根據(jù)劑型的不同和疾病嚴重程度，使用劑量超出該范圍。

下面是本發(fā)明部分化合物藥效學實驗和結果：

一、化合物對流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染MDCK細胞的抑制活性

MDCK細胞按5×10³個/孔濃度接種到96孔板中，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)形成細胞單層。細胞用PBS洗2次，加入100TCID₅₀流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染細胞，每孔100μl，37℃孵育2h后棄去病毒液。分別加入含不同濃度(160、80、40、20μM)本發(fā)明化合物和先導化合物BANA-206的維持培養(yǎng)液，實驗同時設正常細胞對照組、病毒模型對照組及陽性對照藥奧司他韋10μM。MDCK細胞于37℃培養(yǎng)48h，每日觀察細胞病變。并用MTT法測定細胞活力，實驗共重復3次，計算病毒抑制率。病毒抑制率％＝(OD_加藥組－OD_{病毒對照組})/(OD_{正常細胞對照組}－OD_{病毒對照組})×100％

實驗結果表明：本發(fā)明化合物在160μM和80μM濃度下均表現(xiàn)出明顯的抗流感病毒活性，而先導化合物BANA-206在160μM濃度下沒有明確的抑制作用，其中化合物Ⅰ-5病毒抑制活性最強，在20μM濃度下仍具有22.6％的抑制率(表1)，故優(yōu)選化合物Ⅰ-5進行下一步抗流感病毒活性研究。

表1化合物對流感病毒A/FM/1/47(H1N1)的抑制活性

二、化合物Ⅰ-5的細胞毒性及其對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)、A/Beijing/32/92(H3N2)和奧司他韋耐藥突變株A/FM/1/47-H275Y(H1N1-H275Y)感染MDCK細胞病變抑制作用

MDCK細胞按5×10³個/孔濃度接種到96孔板中，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)形成細胞單層。將本發(fā)明化合物Ⅰ-5用維持培養(yǎng)液配制成不同濃度加入MDCK細胞中，使得孔中藥物終濃度為20、40、80、160、320、640μM。實驗設不加藥的正常細胞對照組，將細胞置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，用MTT法測定細胞活力，確定最大無毒濃度，實驗重復 3次，并計算化合物對MDCK細胞的半數(shù)毒性濃度(CC₅₀)。

表2化合物Ⅰ-5對MDCK細胞的細胞毒性

根據(jù)化合物Ⅰ-5在MDCK細胞上毒性實驗結果(表2)，實驗設置正常細胞對照組、病毒模型組、陽性對照奧司他韋10μM和化合物Ⅰ-5組(設5個不同濃度)。MDCK細胞按5×10³個/孔濃度接種到96孔板中，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)形成細胞單層。細胞用PBS洗滌2次，分別加入100TCID₅₀流感病毒A/FM/1/47(H1N1)、A/Beijing/32/92(H3N2)或A/FM/1/47-H275Y(H1N1-H275Y)感染細胞，每孔100μl，37℃孵育2h后棄去病毒液。分別加入含不同濃度Ⅰ-5的維持培養(yǎng)液，MDCK細胞于37℃培養(yǎng)48h，用MTT法測定細胞活力，實驗共重復3次，計算病毒抑制率及半數(shù)有效濃度(EC₅₀)。病毒抑制率％＝(OD_加藥組－OD_{病毒對照組})/(OD _{正常細胞對照組}－OD_{病毒對照組})×100％

實驗結果表明：流感病毒感染MDCK細胞后，導致MDCK細胞產(chǎn)生細胞病變并死亡，致使細胞數(shù)目明顯減少，細胞活力降低。本發(fā)明化合物對流感病毒H1N1和H3N2在MDCK細胞中的復制和增殖具有較強的抑制作用，且呈劑量依賴關系，見圖1，對于奧司他韋耐藥的突變株H1N1-H275Y也同樣有效，見圖2，表現(xiàn)出良好的CPE抑制作用，見圖3，顯著提高了細胞的存活率。本發(fā)明化合物濃度為80μM時，對流感病毒H1N1的抑制率達到81.1％，對耐藥株H1N1-H275Y的抑制率為72.9％，對流感病毒H3N2的抑制率為42.1％，其EC₅₀值分別為33.6μM，35.2μM和141.7μM，其中對H1N1的抗病毒藥效優(yōu)于H3N2，且有效濃度遠低于細胞毒性試驗測得的該化合物CC₅₀值(687μM)。

三、化合物Ⅰ-5對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的死亡保護率的影響

實驗采用18-20g的ICR小鼠，隨機分為4組，設為正常對照組、病毒模型組、陽性對照磷酸奧司他韋組100mg/kg/d、本發(fā)明化合物Ⅰ-5組100mg/kg/d。適應性培養(yǎng)7天后開始實驗。除正常對照組外，其他各組小鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔內(nèi)接種相當于含8LD₅₀的流感病毒的雞胚尿囊液50μl/只，磷酸奧司他韋組和化合物Ⅰ-5組于感染后2h灌胃給藥，每日1次，每次0.2ml，連續(xù)給藥5天。病毒模型組及正常對照組同法給予0.2ml的生理鹽水。連續(xù)14天觀察小鼠生存狀況，記錄死亡數(shù)和死亡時間。

實驗結果表明口服給藥本發(fā)明化合物對流感病毒感染導致的小鼠死亡有較好的保護作用，明顯延長流感病毒感染小鼠的存活時間，見圖4。給予化合物Ⅰ-5在100mg/kg/d劑量下對 小鼠的死亡保護率為60％，與陽性藥奧司他韋效果相當。與病毒模型組相比，該化合物在體內(nèi)具有明顯的抗流感病毒活性，可以顯著降低小鼠的死亡率，提高小鼠的死亡保護率，延長存活時間。

四、化合物Ⅰ-5對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的體重保護作用

流感病毒感染小鼠后，引發(fā)病毒性肺炎，導致小鼠呼吸不暢、進食減少、體重減輕，所以體重保護是評價藥物對病毒在體內(nèi)增殖的抑制活性的一個重要表觀指標。實驗結果圖5表明，小鼠感染病毒后第5天體重開始下降，并伴隨聳毛、食差、消瘦、蜷縮怕冷、低反應性等疾病癥狀，之后小鼠體重持續(xù)降低，病毒模型組下降幅度最大。由于化合物Ⅰ-5和磷酸奧司他韋抑制了病毒在小鼠肺部的增殖，相較于病毒組，給藥組小鼠體重下降并不十分明顯，在一定程度上表現(xiàn)出對小鼠的體重保護作用。同時，給藥組小鼠感染癥狀相對病毒組得到改善，并且在10天后，體重恢復并增加，部分小鼠的感染癥狀減少并消失。表明口服給藥Ⅰ-5對小鼠體重有一定程度的保護作用，進一步證明了該化合物在體內(nèi)的抗流感病毒活性。

附圖說明

圖1是化合物Ⅰ-5對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)和A/Beijing/32/92(H3N2)感染MDCK細胞病變的抑制率

圖2是化合物Ⅰ-5對奧司他韋耐藥突變株A/FM/1/47-H275Y(H1N1-H275Y)感染MDCK細胞病變的抑制率

圖3是化合物Ⅰ-5對奧司他韋耐藥突變株A/FM/1/47-H275Y(H1N1-H275Y)感染MDCK細胞的保護作用

圖4是化合物Ⅰ-5對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的生存保護作用

圖5是化合物Ⅰ-5對甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的體重保護作用

具體實施方式

實施例1

關鍵中間體部分的合成

2-[4-(乙氧羰基)苯胺基]丙二酸二乙酯(C)的制備

500mL茄形瓶中加入30g(181.82mmol)對氨基苯甲酸乙酯(A)與20g(84.03mmol)溴代丙二酸二乙酯(B)，115℃反應24h后，用乙醚溶解過濾，濾液用10％鹽酸洗滌3次，水洗3次，無水硫酸鈉干燥。過濾靜置析出晶體。抽濾并用少量乙醚洗滌，得23g無色晶體C，產(chǎn)率85.0％。m.p：68～72℃。

MS[M+H]⁺:324.1；

¹H NMR(500MHz,CDCL₃),δ:7.9(d,2H,J＝8.8Hz,ArH)；6.6(d,2H,J＝8.8Hz,ArH)；5.2(d,1H,J＝7.2Hz,CH)；4.8(d,1H,J＝7.2Hz,NH)；4.33～4.37(m,2H,CH₂)；4.3(m,4H,2CH₂)；1.35～1.38(t,3H,J＝7.2Hz,CH₃)；1.11～1.14(t,6H,J＝7.2Hz,2CH₃).

1-[4-(乙氧羰基)苯基]-5,5-二甲酸二乙酯-2-吡咯烷酮(D)的制備

250mL茄形瓶中加入5.60g(17.34mmol)化合物C，50mL無水乙醇，攪拌溶解。量取16mL無水乙醇，切取0.48g(20.81mmol)鈉加入其中，制備乙醇鈉，將乙醇鈉滴加入反應液，反應液變黃。滴加3.69mL(34.68mmol)丙烯酸乙酯溶于10mL無水乙醇的溶液，20℃反應20h后滴加冰乙酸中和旋干。乙酸乙酯、水萃取，無水Na₂SO₄固體干燥，過濾，柱層析分離得5.58g油狀產(chǎn)物，產(chǎn)率85.5％。

MS[M+H]⁺:378.10；

¹H NMR(500MHz,CDCL₃),δ:8.01～8.03(d,2H,J＝9Hz,ArH),7.38～7.40(d,2H,J＝9Hz,ArH),4.33～4.37(m,2H,CH₂),4.14～4.19(m,4H,2CH₂),2.70～2.73(t,2H,J＝7.5Hz,CH₂),2.61～2.64(t,2H,J＝7.5Hz,CH₂),1.35～1.38(t,3H,J＝7.2Hz,CH₃),1.11～1.14(t,6H,J＝7.2Hz,2CH₃).

1-[4-(乙氧羰基)-2-硝基苯基]-5,5-二甲酸二乙酯-2-吡咯烷酮(E)的制備

100mL三頸瓶中加入4.66g(12.36mmol)化合物D，23.3mL冰乙酸，34.95mL乙酸酐，攪拌溶解。冰鹽浴至-10℃，量取5.83mL(142.76mmol)發(fā)煙硝酸，緩慢加入反應液中，反應24h，停止反應。將反應液倒入冰水中，加入Na₂CO₃固體并攪拌至沒有氣體生成。再用飽和Na₂CO₃溶液洗滌3次，再加入無水Na₂SO₄固體干燥，靜置，過濾，旋干得黃色油狀液體3.86g，產(chǎn)率74.1％。

MS[M+H]⁺:424.14.

4-[2,2-(二羥甲基)-5-吡咯烷酮基]-3-硝基苯甲酸乙酯(F)

100mL單頸瓶中加入2.4g(5.69mmol)化合物E。量取24mL無水乙醇、24mL無水THF倒入瓶中，攪拌，冰鹽浴至-10℃，分批加入1g(26.40mmol)NaBH₄后撤去冰鹽浴，室溫反應，TLC監(jiān)測反應完成后，滴加10％HCL中和，旋干溶劑，用乙酸乙酯/水萃取3次，20mL水洗滌2次，加入Na₂SO₄固體干燥，靜置，過濾，柱層析分離得油狀物1.06g，產(chǎn)率55.2％。

MS[M+H]⁺:339.1.

3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)的制備

250mL茄形瓶中加入0.6g(1.78mmol)化合物F。80mL乙醇溶解，油浴50℃。將2.16g(12.46mmol)低亞硫酸鈉溶于13mL水中，滴加入上述溶液中，滴加完畢后油浴升溫至 75℃，TLC監(jiān)測反應完成后，冷卻至室溫，過濾，濾液旋除溶劑，用乙酸乙酯/水萃取，水層反復萃取，收集有機層，無水硫酸鈉干燥，靜置，過濾，旋除溶劑得黃色油狀物0.28g，產(chǎn)率51.1％。

MS[M+H]⁺:309.2.

1-[4-(乙氧羰基)苯基]-5-甲酸乙酯-2-吡咯烷酮(G)的制備

250mL茄形瓶中加入5.60g(17.34mmol)化合物C，50mL無水乙醇，攪拌溶解。量取16mL無水乙醇，切取0.48g(20.81mmol)鈉加入其中，制備乙醇鈉，將乙醇鈉滴加入反應液，反應液變黃。滴加3.69mL(34.68mmol)丙烯酸乙酯溶于10mL無水乙醇的溶液，加熱回流反應20h后滴加冰乙酸中和旋干。乙酸乙酯/水萃取，無水硫酸鈉固體干燥，過濾，柱層析(PE：EA＝10：1)分離得3.99g油狀產(chǎn)物G，產(chǎn)率75.5％。

MS[M+H]⁺:306.1；

¹H NMR(500MHz,CDCL₃)；δ:8.01～8.04(m,2H,ArH)；7.26～7.61(m,2H,ArH)；4.75～4.78(m,1H,CH)；4.33～4.37(m,2H,CH₂)；4.16～4.21(m,2H,CH₂)；2.73～2.77(m,1H,1/2CH₂)；2.56～2.62(m,1H,1/2CH₂)；2.46～2.54(m,1H,1/2CH₂)；2.17～2.23(m,1H,1/2CH₂)；1.36～1.39(t,3H,J＝7.2Hz,CH₃)；1.19～1.21(t,3H,J＝7Hz,CH₃).

1-[4-(乙氧羰基)-2-硝基苯基]-5-甲酸乙酯-2-吡咯烷酮(H)

250mL茄形瓶中加入4.66g(15.28mmol)化合物G，23.3mL冰乙酸，34.95mL乙酸酐，攪拌溶解。冰鹽浴至-10℃，量取5.825mL(142.76mmol)發(fā)煙硝酸，緩慢加入反應液中，反應24h，停止反應。將反應液倒入冰水中，加入Na₂CO₃固體并攪拌至沒有氣體生成。再用飽和Na₂CO₃溶液洗滌3次，再加入無水Na₂SO₄固體干燥，靜置，過濾，旋干得黃色油狀液體2.4g，產(chǎn)率45.0％。

MS[M+H]⁺:351.1；

¹H NMR(500MHz,CDCL₃)；δ:8.64～8.65(s,1H,ArH)；8.26～8.28(d,1H,J＝10.5Hz,ArH)；7.55～7.60(d,1H,J＝10Hz,ArH)；4.67～4.69(m,1H,CH)；4.39～4.44(m,2H,CH₂)；4.16～4.22(m,2H,CH₂)；2.60～2.79(m,2H,CH₂)；2.50～2.57(m,1H,1/2CH₂)；2.30～2.35(m,1H,1/2CH₂)；1.36～1.41(t,3H,J＝7.2Hz,CH₃)；1.18～1.23(t,3H,J＝7Hz,CH₃).

4-[2-(羥甲基)-5-吡咯烷酮基]-3-硝基苯甲酸乙酯(I)

100mL單頸瓶中加入2.4g(6.86mmol)化合物H。量取24mL無水乙醇、24mL無水THF倒入瓶中，攪拌，冰鹽浴至-10℃，分批加入0.5g(13.20mmol)NaBH₄后撤去冰鹽浴，室溫反應，TLC監(jiān)測反應完成后，滴加10％HCL中和，旋干溶劑，用乙酸乙酯/水萃取3次，20mL水洗滌2次，加入Na₂SO₄固體干燥，靜置，過濾，制沙，柱層析(PE︰EA＝10︰1)分離得油 狀物1.06g，產(chǎn)率50.2％。

MS[M+H]⁺:309.1；

¹H NMR(500MHz，CDCL₃)，δ:7.57～7.59(d,2H,J＝7Hz,ArH)；7.12～7.13(d,H,J＝8.5Hz,ArH)；4.32～4.36(m,2H,CH₂)；4.08～4.12(m,H,CH)；4.16～4.21(m,2H,CH₂)；3.78(s,1H,OH)；3.34～3.47(m,2H,CH₂)；2.68～2.75(m,1H,1/2CH₂)；2.55～2.62(m,1H,1/2CH₂)；2.30～2.38(m,1H,1/2CH₂)；2.23～2.27(m,1H,1/2CH2)；1.35～1.37(t,3H,J＝7Hz,CH3).

3-氨基-4-[2-(羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅲ)

250mL茄形瓶中加入2.01g(6.52mmol)化合物F。80mL乙醇溶解，油浴50℃。將7.94g(45.64mmol)低亞硫酸鈉溶于28mL水中，滴加入上述溶液中，滴加完畢后油浴升溫至75℃，TLC監(jiān)測反應完成后，冷卻至室溫，過濾，濾液旋除溶劑，用乙酸乙酯/水萃取，水層反復萃取，收集有機層，無水硫酸鈉干燥，靜置，過濾，旋除溶劑得黃色泡沫狀物0.7g,產(chǎn)率38.9％。

實施例2

Ⅳ系列中間體的合成

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]-3-[3-(2-甲基苯甲?；?硫脲基]苯甲酸乙酯(Ⅳ-1)

將硫氰酸銨0.41g(5.39mmol)和無水丙酮8mL加入25mL三頸瓶中，5min內(nèi)滴入鄰甲基苯甲酰氯0.68g(4.40mmol)溶于15mL丙酮，回流20min，再緩慢滴加3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)0.73g(2.37mmol)溶于15mL丙酮。繼續(xù)回流12h。減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得到白色固體0.41g，產(chǎn)率35.44％。m.p.141～143℃。

[M+K]⁺：524.1；

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ(ppm)：12.55(s，1H，NH)；11.76(s，1H，NH)；9.08(s，1H，ArH)；7.85～7.88(m，1H，ArH)；7.41～7.54(m，3H，ArH)；7.29～7.32(m，2H，ArH)；5.31(s，1H，OH)；4.89(s，1H，OH)；4.31～4.38(q，2H，J＝6.9Hz，CH₂)；3.48～3.54(m，2H，CH₂)；3.33(s，3H，CH₃)；3.17～3.22(m，2H，CH₂)；2.40～2.44(m，2H，CH₂)；2.21～2.20(m，2H，CH₂)；1.31～1.35(t，3H，J＝7.05Hz，CH₃)。

IR(cm^-1)：3508,3423,3240,1712,1670,1633,1593,1550,1396,1058,856,759.

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]-3-(3-α-萘甲酰硫脲基)苯甲酸乙酯(Ⅳ-2)

將硫氰酸銨0.41g(5.39mmol)和無水丙酮8mL加入25mL三頸瓶中，5min內(nèi)滴入α-萘甲酰氯0.90g(4.40mmol)溶于15mL丙酮，回流20min，再緩慢滴加3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5- 氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)0.73g(2.37mmol)溶于15mL丙酮。繼續(xù)回流12h。減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得白色固體1.02g，收率82.53％。

[M+K]⁺：560.1；

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ(ppm)：12.60(s，1H，NH)；12.03(s，1H，NH)；9.10(s，1H，ArH)；8.12～8.16(m，2H，ArH)；8.03～8.06(m，1H，ArH)；7.87～7.90(m，1H，ArH)；7.78～7.80(m，1H，ArH)；7.54～7.67(m，4H，ArH)；5.33(s，1H，OH)；4.98(s，1H，OH)；4.33～4.37(m，2H，CH₂)；3.52～3.55(m，2H，CH₂)；3.20～3.28(m，2H，CH₂)；2.49～2.50(m，1H，1/2CH₂)；2.45～2.49(m，2H，CH₂)；1.32～1.36(t，3H，J＝7.05Hz，CH₃)；1.02～1.07(m，1H，1/2CH₂).

IR(cm^-1)：3417,3236,2977,2360,1714,1523,1496,1396,1292,1217,1157,1024,902,783.

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]-3-(3-仲丁基硫脲基)苯甲酸乙酯(Ⅳ-3)

將硫氰酸銨0.41g(5.39mmol)和無水丙酮8mL加入25mL三頸瓶中，5min內(nèi)滴入仲丁酰氯0.53g(4.40mmol)溶于15mL丙酮，回流20min，再緩慢滴加3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)0.73g(2.37mmol)溶于15mL丙酮。繼續(xù)回流12h。減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得白色固體0.88g，收率82.31％。

MS[M+H]⁺:452.18.

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]-3-(3-異戊基硫脲基)苯甲酸乙酯(Ⅳ-4)

將硫氰酸銨0.41g(5.39mmol)和無水丙酮8mL加入25mL三頸瓶中，5min內(nèi)滴入異戊酰氯0.59g(4.40mmol)溶于15mL丙酮，回流20min，再緩慢滴加3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)0.73g(2.37mmol)溶于15mL丙酮。繼續(xù)回流12h。減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得白色固體0.97g，收率88.10％。

MS[M+H]⁺:466.20.

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]-3-(3-環(huán)己基甲酰硫脲基)苯甲酸乙酯(Ⅳ-5)

將硫氰酸銨0.41g(5.39mmol)和無水丙酮8mL加入25mL三頸瓶中，5min內(nèi)滴入環(huán)己基甲酰氯0.64g(4.40mmol)溶于15mL丙酮，回流20min，再緩慢滴加3-氨基-4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷酮基]苯甲酸乙酯(Ⅱ)0.73g(2.37mmol)溶于15mL丙酮。繼續(xù)回流12h。減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得白色固體0.59g，收率52.13％。m.p.164～166℃。

HR-MS(ESI):m/z[M+H]⁺calcdforC₂₃H₃₁N₃₆O₆S:478.1901；Found：478.1911。

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ(ppm)：12.45(s，1H，NH)；11.43(s，1H，NH)；8.93(s，1H，ArH)；7.82～7.86(m，1H，ArH)；7.46～7.48(d，1H，J＝8.28Hz，ArH)；5.31(s，1H， OH)；4.86(s，1H，OH)；4.27～4.34(q，2H，J＝7.05Hz，CH₂)；3.07～3.11(m，2H，CH₂)；2.63～2.68(m，2H，CH₂)；2.35～2.47(m，2H，CH₂)；2.14～2.29(m，2H，CH₂)；1.90～1.93(m，2H，CH₂)；1.74～1.76(m，2H，CH₂)；1.62～1.67(m，1H，CH)；1.41～1.51(m，2H，CH₂)；1.30～1.38(m，2H，CH₂)；1.17～1.26(m，2H，CH₂)1,.27～1.32(t，3H，J＝7.14Hz，CH₃).

IR(cm^-1)：3419,2933,1718,1683,1583,1535,1290,1159,1018,941,769.

實施例3

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-[5-(2-甲基苯基)-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-1)的制備

將化合物(Ⅳ-1)0.25g(0.51mmol)，1滴乙酸酐和0.1ml水合肼在10ml無水乙醇中混合，N₂保護下，回流6小時，減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得淡黃色油狀物0.15g，收率62.7％。將此油狀物用10ml甲醇溶解，加入2N NaOH溶液1ml，室溫攪拌，TLC監(jiān)測至原料點消失，旋除甲醇，加入10％HCl調(diào)PH＝2～3，有白色固體析出，抽濾烘干得白色固體40mg，產(chǎn)率29.0％。m.p.224～226℃

[M+H]⁺：438.2；

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ(ppm)：13.23(s，1H，COOH)；9.03(s，1H，NH)；8.91(s，1H，NH)；7.65～7.68(m，1H，ArH)；7.40～7.45(m，1H，ArH)；7.28～7.34(m，1H，ArH)；7.19～7.23(m，1H，ArH)；5.18(s，1H，OH)；4.11～4.12(m，1H，CH)；4.04～4.12(m，2H，CH₂)；1.87(m，1H，CH).

IR(cm^-1)：3409,3244,2925,2366,1683,1650,1637,1600,1558,1508,1456,1436,1031,985.

實施例4

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(-萘基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-2)的制備

將化合物(Ⅳ-2)0.20g(0.38mmol)，1滴乙酸酐和0.1ml水合肼在10ml無水乙醇中混合，N₂保護下，回流6小時，減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得黃色油狀物0.19g，收率47.80％。將此泡沫狀物用10ml甲醇溶解，加入2N NaOH溶液1ml，室溫反應，TLC監(jiān)測至原料點消失，旋除甲醇，加入10％HCl調(diào)PH＝2～3，有灰白色固體析出，抽濾烘干得灰白色固體39mg，收率21.7％。m.p.248～250℃。

[M-H]^-：472.1；

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ(ppm)：13.23(s，1H，COOH)；8.91(s，1H，NH)；8.07(s，1H，NH)；7.91～7.97(m，1H，ArH)；7.58～7.64(m，1H，ArH)；7.45～7.47(m，1H， ArH)；7.19～7.23(m，1H，ArH)；5.18(s，1H，OH)；4.11～4.12(m，1H，CH)；4.04～4.12(m，2H，CH₂)；1.87(m，1H，CH).

IR(cm^-1)：3411,2925,1662,1654,1635,1596,1558,1508,1434,1398,1211,1026,808,773.

實施例5

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-仲丁基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-3)的制備

將化合物(Ⅳ-3)0.25g(0.55mmol)，1滴乙酸酐和0.1ml水合肼在10ml無水乙醇中混合，N₂保護下，回流6小時，減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得黃色油狀物0.20g，收率84.37％。將此泡沫狀物用10ml甲醇溶解，加入2N NaOH溶液1ml，室溫反應，TLC監(jiān)測至原料點消失，旋除甲醇，加入10％HCl調(diào)PH＝2～3，有白色固體析出，抽濾烘干得白色固體34mg，產(chǎn)率24.27％，mp：155～156℃。

MS[M+H]+:404.1；

1H NMR(500MHz,CDCl3)；δ(ppm)：12.85(s,1H,NH)；8.94(s,1H,NH)；8.67(s,1H,ArH)；7.37～7.40(d,1H,J＝8Hz,ArH)；7.26～7.28(d,1H,J＝8Hz,ArH)；3.32～3.36(m,3H,CH2)；3.08～3.11(m,1H,1/2CH2)；2.49～2.50(m,1H,CH)；2.36～2.47(m,2H,CH2)；2.24～2.30(m,1H,1/2CH2)；2.15～2.20(m,1H,1/2CH2)；1.65～1.70(m,1H,1/2CH2)；1.54～1.59(m,1H,1/2CH2)；1.21～1.23(m,3H,CH3)；0.81～0.84(t,3H,J＝7Hz,CH3)；

IR(cm-1):3543,3414,1681,1635,1616,1556,1384,1120,623,484.

實施例6

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-異戊基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-4)的制備

將化合物(Ⅳ-4)0.25g(0.54mmol)，1滴乙酸酐和0.1ml水合肼在10ml無水乙醇中混合，N₂保護下，回流6小時，減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得黃色油狀物0.22g，收率91.96％。將此泡沫狀物用10ml甲醇溶解，加入2N NaOH溶液1ml，室溫反應，TLC監(jiān)測至原料點消失，旋除甲醇，加入10％HCl調(diào)PH＝2～3，有白色固體析出，抽濾烘干得白色固體34mg，產(chǎn)率24.27％，mp：155～156℃。

MS[M+H]+:418.2；

1H NMR(500MHz,CDCl3)；δ(ppm)：12.98(s,1H,NH)；8.94(s,1H,NH)；8.68(s,1H,ArH)；7.37～7.38(m,1H,ArH)；7.26～7.28(d,1H,J＝8Hz,ArH)；5.86(s,1H,OH)；5.20(s,1H,OH)； 3.32～3.36(m,3H,CH2)；3.08～3.11(m,1H,1/2CH2)；2.50～2.63(m,1H,1/2CH2)；2.36～2.47(m,2H,CH2)；2.24～2.30(m,1H,1/2CH2)；2.14～2.20(m,1H,1/2CH2)；1.61～1.68(m,4H,2CH2)；0.77～0.80(t,6H,J＝7Hz,2CH3)；

IR(cm-1):3416,1647,1618,1552,1452,1384,1257,1072,626.

實施例7

4-[2,2-(二羥甲基)-5-氧代吡咯烷基]-3-(5-環(huán)己基-4H-1,2,4-三氮唑基-3-氨基)苯甲酸(Ⅰ-5)的制備

將化合物(Ⅳ-5)0.41g(0.86mmol)，1滴乙酸酐和0.17ml水合肼在10ml無水乙醇中混合，N₂保護下，回流6小時，減壓蒸去溶酶，殘留物用柱層析分離(CH₂CL︰CH₃OH＝50︰1)，得白色泡沫狀物0.23g，收率58.13％。將此泡沫狀物用10ml甲醇溶解，加入2N NaOH溶液1ml，室溫反應，TLC監(jiān)測至原料點消失，旋除甲醇，加入10％HCl調(diào)PH＝2～3，有黃色固體析出，抽濾烘干得黃色固體80mg，產(chǎn)率36％。m.p.228～230℃。

HR-MS(ESI):m/z[M+H]⁺calcdforC₂₁H₂₇N₅O₅:430.2085；Found：430.2079.

¹H NMR(500MHz，DMSO)δ(ppm)：12.92(s，1H，COOH)；8.92(s，1H，NH)；8.65(s，1H，NH)；7.70～7.72(m，1H，ArH)；7.34～7.38(m，1H，ArH)；7.25～7.27(m，1H，ArH)；5.85(s，1H，OH)；5.20(s，1H，OH)；3.07～3.11(m，2H，CH₂)；2.63～2.68(m，2H，CH₂)；2.35～2.47(m，2H，CH₂)；2.14～2.29(m，2H，CH₂)；1.90～1.93(m，2H，CH₂)；1.74～1.76(m，2H，CH₂)；1.62～1.67(m，1H，CH)；1.41～1.51(m，2H，CH₂)；1.30～1.38(m，2H，CH₂)；1.17～1.26(m，2H，CH₂).

IR(cm^-1)：3320,2854,1750,1654,1628,1586,1458,1421,1378,1291,1046,860,753。